第四章 酶学检测技术

S为底物 P为产物
酶学测定技术
延滞期
底物多，产物 少，一般不做 为检测阶段。
线性期
底物过量，时 间进程曲线呈 直线或接近直 线状态，反应 速率变化不大 （零级反应）。
非线性期
底物浓度明显 减少，产物增 加，反应速率 下降，酶促反 应进程曲线偏 离直线（一级
反应）。
酶学测定技术
酶活性测定 方法
定时法
酶学测定技术
影响酶活性测定的方法因素 （一）基本方法因素
1、方法类型的选择 2、正反应与逆反应 3、检测底物或检测产物 4、底物启动模式与样本启动模式 5、副反应问题 6、延滞期与线性期的确定 （二）检测系统的影响 1、仪器 2、校准器 3、实验参数 4、样本与试剂比例
酶学测定技术
酶质量免疫化学测定法的评价
1、灵敏度高 2、特异性高 3、能用于一些不表 现活性的酶蛋白
优点
1、要制备足够量的提纯酶 作为抗原和具有免疫化学 性质的抗血清常常是很困 难的 2、测定步骤多，操作繁琐 3、测定成本高
缺点
代谢物的酶法分析
酶法分析（enzymatic method）是利用酶的作用性质，以酶 作为分析工具或分析试剂的主要成分进行体系中底物、辅酶、 抑制剂和激活剂等成分含量测定的方法。
第四章 酶学检测技术
制作人：燕燕
酶学检测
1.概述 2.酶学测定技术 3.代谢物的酶学分析 4.同工酶检测
概述
酶（enzyme，E）是具有催化作用的生物大分子。
酶所催化的反应物称为酶的底物（substrate，S） ，其产物称为(product，P），酶的催化能力大小 称为酶的活性（activity）。
GLU+O₂+H₂O GODGA+H₂O₂ 2H₂O₂+4-AAP+酚 POD红色醌类化合物+H₂O+O₂ 红色醌类物质在505nm有吸收峰，其吸光度增加与标本中懂得葡 萄糖浓度成正比。
酶学测定技术
酶活性测定条件的优化 1、底物的种类和浓度 2、缓冲液 3、反应温度 4、辅酶、辅基和激活剂 5、抑制剂 6、酶偶联法中的辅助酶和指示酶 7、酶的种类、用量 8、测定方法 9、标本与试剂的比例（10：1）
缺点：对仪器的要求高。
连续检测法的方法类型： 1、直接连续检测法 2、间接连续检测法（包括一步间接法和酶欧联法）
酶学测定技术
举例
GLU+ATP HK G-6-P+ADP G-6-P+NADP G-6-PD 6-PGA+NADPH NADPH 在340nm有吸收峰，其吸收率增加与标本中的葡萄糖浓 度成正比。
THANKS
优点： 1、酶作用的特异性高 2、试剂酶的本质大多是蛋白质，无毒性，避免了化学品对环 境的污染 3、酶促反应的条件温和，可用于自动化分析。
同工酶测定
（一）按照理化性质不同进行检测 1、电泳法 2、层析法
（二）按照其他性质不同进行检测 1、按照底物专一性不同 2、按照最适pH不同 3、按照免疫学特性不同 4、按照耐热程度不同
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连续监 测法
酶学测定技术
定时法特点： 优点：设备简单，操作方便，检测过程中不需要恒温 设备，不用考虑显色剂对酶活性的影响。 缺点：不能确保选定的测定时段全部处于线性期，因 此测定误差难以估计。
定时法酶活性的计算可以利用标准比较法、标准曲线 法或吸光系数法等。
酶学测定技术
连续检测法的特点： 优点：不需要终止酶促反应，不需要添加其他显色剂；可以 明确找到反应的线性期，结果准确可靠；标本和试剂用量少 ，可在短时间内完成测定。
与检测
在受热、震荡、 紫外线照射、酸 碱作用下易失活
高效性
比普通化学催化 剂高百万倍
高度特异性
对作用物的选 择性强，一种 只催化一种或 一类物质
可调节性
可通过条件变 化改变催化反 应的快慢
酶学测定技术
酶活性测定主要利用酶具有催化活性，能 加快化学反应速度的特性，测定单位时间 内底物消耗量（-d[s]/dt）或产物生成量 （d[P]/dt），计算酶促反应的速率，确 定酶活性浓度的高低。
酶学测定技术
酶活性浓度的表示方法
惯用单位
了解，应用不便， 现已少用。
国际单位
在特定条件下， 1分钟内转变1微 摩尔底物的酶量 为一个国际单位。
Katal单位
在规定条件下， 每秒钟催化1摩 尔底物转化为所 需要的酶量。
酶活性浓度单位
以单位体积所含 的酶活性单位数
表示。
酶学测定技术
酶促反应时间进程曲线
概述
酶
1.单体酶 2.寡聚酶 3.多酶复合物 4.多功能酶（串联酶）
1.单纯酶 2.结合酶
概述
酶的分类
1.氧化还原酶（最重要） 2.转移酶 3.水解酶类 4.裂合酶类 5.异构酶类 6.合成酶类
概述
酶的作用特点
特殊的结构和性能
高度不稳定性
保证了生物体内 多种复杂生物反 应的正常运行， 也可根据这些特 性进行酶的分析