甾体微生物转化C_11_羟基化的研究进展

近年来, C11 羟基的研究发展较快[ 1] 。氢化可 的松( Hydrocortisone, HC) 是重要的皮质激素药物, 在 临床上主要用于治疗胶原性疾病, 如风湿热, 风湿性 关节炎, 红斑狼疮, 过敏性疾病及阿狄森氏病, 也用 于昏迷、休克、严重感染的抢救等。它也是重要的基 本骨干皮质甾体激素药物之一, 且又是出口创汇的 主要原料药和制备高档皮质激素的中间体, 在我国 甾体药业生产中占有较大的份额, 在国内外市场上 需求量也很大。1951 年 Wendler 等[ 2] 用合成法合成 HC, 但是步骤多, 得率低, 因而以后转用微生物转化
中图分类号: Q93
文献标识码: A
文章编号: 1672- 3678( 2006) 02- 0007- 08
Progress of study on C11 hydroxylation of steroid by microbial transformation
YANG Shun kai1 , YI Kui xing2, YANG Ya li1 , ZHANG Tian zhi3
早在上世纪 70~ 90 年代, 俄罗斯科学院微生物 生理生化研究所就用选到的新月弯孢霉( Curvularia lunata VKM F 644) 对 RS, RSA, 17 羟醋酸酯 RSA 进 行 C11 羟基化生产 HC 做过系统研究, 对投料浓度、
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菌丝量、菌龄、接种方式、底物添加方式、转化时间等 做了比较实验, 确立 了此反应的相关过程参数[13] 。 黄淑惠等对新 月弯孢霉 C11 羟基化 16 甲基 RSA
前苏联学者 Angelora 较系统地开展了新月弯孢 霉( Curvularia lanata) BKM F 644 菌株对甾体底物的 C11 羟基化作用的相关研究[10] 。他们在对 15 株小
克银汉霉属( Cunninghamella) 和 6 株弯孢霉属( Cur vularia) 菌种直接进行定向筛选具有对甾体底物 RS 和 RSA 进行 C11 羟基化生物转化能力的基础上, 发 现小克银汉霉属的培 养物产生了多种甾体羟 基化
进行了研究, 也表明新月弯孢霉 C11 羟基化的转化 能力[ 14] 。曾本秀等对新月弯孢霉对甾体 C11 羟基 化的研究也作了部分研究工作, 对菌丝体的培养、底 物的添加浓度及时间、转化条件等进行了一些试验 研究[ 15] 。本实验室通过对新月弯孢霉 AS3 4381 菌 株的选择, 发酵工艺的改进, 提高了投料浓度及总甾 体量的回收率, HC 产率较现有的蓝色犁头霉显著提 高, 有望投入工业化开发[ 6 7] 。
摘 要: C11 羟基化是甾体微生物转化中难以实现的一步 反应。对 甾体 C11 羟基化的机理及部分生理生化问题进 行了讨论, 对蓝色犁头霉和新月弯孢霉催化转化 甾体 C11 羟基化的应用研究特点及其催化转化反应产物氢化可的 松的工业生产现状及相关问题进行了评述, 并对 此技术开发前景进行了预测。
关键词: 蓝色犁头霉; 新月弯孢霉; C11 羟基化; 氢化可的松
Abstract: C11 hydroxylat ion is one of the most difficult microbial conversion of steroids for production of hydrocort isone. The basic principle about C11 hydroxylation of steroids by A bsidia orchidis and Curvularia lu nata and some related technological problems were discussed in this article, and the development perspect ive of industrial biotechnology of production of hydrocort isone was addressed. Key words: Absidia orchidis ; Curvularia lunata; C11 hydroxylat ion; hydrocortisone
收稿日期: 2005 09 21 基金项目: 云南积大制药有限公司和云南丽江映华生物药业有限公司资助课题。 作者简介: 杨顺楷( 1943 ) , 研究员, 主要从事微生物转化及酶法合成和生物加工过程的研究。E mail: yangsk@ cib. ac. cn
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生物加工过程
第 4 卷第 2 期
氧化专一性不够 理想, 成 品中除了 HC 外, 还产生 C11 羟基化合物, 即表氢化可的松, 以及少量其他位 置的羟基化合物, 副产物的量比较大; 所以 HC 的总 收率不是很理想, 其产率平均维持在 45% 左右( 以 化合物 S 醋酸酯( RSA) 计) [ 5] 。早在 1953 年, 国外就 已经有了用新月弯孢霉( Curvularia lunata) 转化制备 HC 的报道。本实验室通过对以上两株菌种的选育 比较, 发酵条件的优化, 提高了 HC 的净产率, 应用 改进的发酵工艺, 使用新月弯孢霉 AS3 4381 菌株可 以使 HC 的收率达到 55% ~ 60% ( 以 RS 计) [ 6 7] 。本 文将结合本实验室的工作, 就国内外有关对甾体 C11
( 1. Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041, China; 2. College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China; 3. College of Pharmacy, Sichuan University, Chengdu 610041, China)
培养基的组成对霉菌的生长和转化有很大的影 响。甾体生物转化具有明显两阶段的特征, 即微生 物培养阶段和生物转化阶段。所以在微生物培养阶 段, 要重视对培养基组成的优化, 并进行合理设计, 以获得优质优量的菌丝体细胞, 为第二阶段的甾体 转化奠定基础。
为了保持筛选 C11 羟化菌株过程的简化, 本实 验室通常选用一种培养基, 维持分离获得的各种斜 面菌株的液体生长培养, 通常包括霉菌、酵母、细菌 及放线菌。其初始的组成如下: 葡萄糖 20 g, 黄豆粉 5 g, 氯化钠 5 g, 酵母浸粉 5 g, 磷酸氢二钾 5 g, 蒸馏 水 1 L, 灭菌前 pH 调到 7 0。根据实验项目的需要, 可以对某些成份进行修改, 如果需要配制全可溶性 发酵培养基, 则可用蛋白胨代替黄豆粉, 葡萄糖可用 蔗糖或糊精或淀粉代替。
羟基化的研究进展及应用作一评述。
1 甾体 C11 羟基化生物化学反应的机理
甾体的羟化酶都是细胞色素 P450 依赖型单加氧 酶, 是 P450 末端氧化酶, 其利用分子氧而且需要一个 NADPH 提供 电子 转移 系统。RH + O2 + NADPH + H+ ROH+ H2O + NADP+ 。
中国台湾 Kuo Cheng Chen 等以及国内卢文玉等 对新月弯孢霉 P450 酶在甾体 C11 羟基化过程中的研 究, 证实 P450 酶含量与细胞转化为 HC 能力具有正相 关性[ 8 9] , 真菌甾体羟化酶是细胞色素 P450 单加氧酶。 C11 羟化位上的羟基的立体位置是竖直的, 由于 10 位、13 位角甲基的存在, 造成 C11 竖键羟基的立体 阻碍比 C11 横键羟基位阻大, 这就导致 C11 羟化比 C11 羟化效率低, 而且其副产物也较多。
方法。1952 年 Colingsworth[ 3] 用 链霉菌 ( Streptomyces f radiae) 转化化合物 S( RS) 制得氢化可的松。1958 年 黄鸣龙教授等[ 4] 用黑根霉使 16 , 17 环氧孕甾 4 烯
3, 20 二酮氧化引入 C11 羟基, 从而开 创了自薯蓣 皂素合成可的松的 7 步法新路线。这是我国第一个 用于甾体药物生产的微生物合成。目前国内外都是 采用半合成的工艺路线, 即从天然产物中取得含有 甾体基本骨架的化合物为原料, 通过适当的化学反 应及微生物转化来获得。我国目前一般是用蓝色犁 头霉( Absidia orchidis ) 来进行 HC 的生产, 但由于其
第 4 卷第2 期 2006 年 5 月
生物 加工过 程
Chinese Journal of Bioprocess Engineering
May. 2006 7
甾体微生物转化 C11 羟基化的研究进展
杨顺楷1, 易奎星2, 杨亚力1, 张天智3
( 1. 中国科学院 成都生物研究所, 成都 610041; 2. 四川大学 生命科学学院, 成都 610064; 3. 四川大学 药学院, 成都 610041)
物极低的溶解度( 0 06 g L) ; 而在生产中实际使用的 底物均停留在 0 1% ~ 0 3% 的数量级上; 若采用较 高浓度的甾体底物又局限于使用大量能与水相混溶 的有机溶剂, 而高浓度的有机溶剂导致生物催化剂 酶系统的变性失活。因此, 现行的甾体 C11 羟基化 生物转化过程, 一般选择技术经济可行的有机溶剂 ( 如乙醇) 作为配制甾体底物的溶剂, 然后投加到生 理水相介质体系中进行甾体生物转化过程。当产物 浓度积累到最大值时, 则终止转化反应, 进行产物的 分离回收。 3 1 培养基组成的选择
物, 且 C11 羟基化产物占优势, 目标产物 C11 羟基
化物的含量较低。在这一过程中, 最有效的甾体 C11 羟基化菌是新月弯孢霉( Curvularia lunata) VKM F
644 和 VNICFI 两株菌, 它们对 RS 和 RSA 呈现了最 高的 C11 羟基化活性, 积累的转化产物量达到 50% ( RS 为底物) ; HC 与副产物 14 羟基 RS 的数量比在 2!1~ 2 5!1 的范围内; 对 RSA 的转化过程, 这两株 菌均 能 生 成 C11 羟 基 化 产 物 HC, 数 量 分 数 为
37 5% , 副产物 14 羟基 RS 为 25% , 主副产物之比 为 1 5!1; 尚存留 20% ~ 25% 的底物 RSA。可见, 以 RSA 作为转化产物, 都要经菌丝培养物的脱乙酰化 ( 水解) 生成 RS, RS 再被液体菌丝培养物的 C11 羟化
酶系催化生成相应的甾体羟化产物, 即目标产物 HC 和副产物 14 羟基 RS。
2006 年 5 月
杨顺楷等: 甾体微生物转化 C11 羟基化的研究进展
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3 甾体 C11 羟基化生物转化过程涉及的部 分生理生化问题
迄今为止, 对微生物细胞甾体 C11 羟化酶体系 的机理研究工作仍较薄弱。文献资料有关甾体 C11
羟基化的报道仍是相互矛盾的。 C11 羟基化过程具有低效率的特征, 受制于底
一般说来, 新月弯孢霉对底物 RSA 具有较低的 脱乙酰活性, 而犁头霉 AS3 65 却对 RSA 呈现 较高 的脱乙酰活性, 转化过程为: RSA RS HC 及副产 物。这就是国内工业生产 HC 采用 RSA 作底物进行 生物转化的菌种特征, 羟 化产物的收率 70% , 产物 中 HC 的质量收率 45% [ 5] 。国外多采用新月弯孢霉 作为生产菌, HC 的 转化率 80% 以 上, 收 率 55% ~ 60% ; 德国先令公司的∀ 双菌#工艺, HC 产率 70% 左 右[ 1] 。
2 具有对甾体进行 C11 羟基化能力的菌种 选择
目前国内生产 HC 的种菌主要是蓝色犁头霉, 近年王敏[ 11 12] 等对此工艺有相关的研究报道。但由 于蓝色犁头霉氧化专一性低, HC 的收率受到限制, 国外大都是用新月弯孢霉进行工业化生产, 国内对 用新 月弯孢霉进行生 物转化生产 HC 也有相关研 究, 但未有投入工业化生产。