测序错误和重复序列对无参照基因组单核苷酸多态性分型的影响_窦锦壮

（１）
根据（１）式 ｍ＝５，Ｃ＝１０ 时 ＳＮＰ 可分 型 的 概 率 只
有３０％左右，即７０％的真实ＳＮＰ 位点因为没有满足最
小等位基因支持度而被当做非多态性位点。可见提高
ＳＮＰ 分型 的 可 靠 率ｒ 和 降 低 ＳＮＰ 可 分 型 概 率ｑ 对 ｍ 的选择是相互矛盾的。
考虑到 ｍ≥２时ｒ≥９８％，为保证有较高的ＳＮＰ 可 分型概率
第 二 代 高 通 量 测 序 技 术 （ＮＧＳ）可 以 在 短 的 时 间 内 以较低的成本 产 生 大 量 的 测 序 数 据，这 些 来 自 于 基 因 组、转录组和蛋 白 质 组 等 不 同 层 面 的 数 据 为 从 系 统 水 平 上 了 解 性 状 变 异 提 供 了 基 础 。 单 核 苷 酸 多 态 性 （Ｓｉｎ－ ｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）是 基 因 组 中 分 布 最广泛，揭示遗传变异理想首选的分 子 标 记，被 广 泛 的 应用于重要疾 病 关 联 的 基 因 筛 选、物 种 遗 传 图 谱 的 构 建、动植物重要经 济 性 状 的 ＱＴＬ 定 位、群 体 遗 传 结 构 和系统演化分析等。
第 ４３ 卷 第 ５ 期 ２０１３ 年 ５ 月
中国海洋大学学报
ＰＥＲＩＯＤＩＣＡＬ ＯＦ ＯＣＥＡＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＨＩＮＡ
４３（５）：１２０～１２４ Ｍａｙ，２０１３
测序错误和重复序列对无参照基因组单核苷酸 多态性分型的影响＊
窦锦壮１，２，赵熙强２，付晓腾１，焦文倩１，王南南２，张玲玲１，胡晓丽１，王 师１＊＊，包振民１
而
（） ∑ ∑ Ｐ（ｎ≥ｍ｜ＡＴ）＝ Ｐｒ（ｉ｜Ｃ／２）
ｉ≥ｍ
ｌ≥ｍ
ｉ ｌ
（１－ ２３ε）ｉ（２３
∑ （） ε）ｉ－ｌ＝ ｉ，ｌ≥ｍ
ｉ ｌ
Ｐｒ（ｉ｜Ｃ／２）（１－
２３ε）ｌ（２３ε）ｉ－ｌ。
所以
（） ∑ ｑ（Ｃ，ｍ，ε）＝１－ （ ｉ，ｌ≥ｍ
ｉ ｌ
Ｐｒ（ｉ｜Ｃ／２）（１－
２３ε）ｉ （２３
ε）ｉ－ｌ）２。
Ｌ′１＝ｃ１ｃ２…ｃｋ…ｃｎ， Ｌ′２＝ｄ１ｄ２…ｄｋ…ｄｎ。 考虑到重 复 序 列 的 存 在 即 存 在 标 签ｃｋ （ｄｋ）＝ ｃｊ （ｄｊ）的情况，令 Ｄｔ代 表 基 因 组 中 所 有ｔ 拷 贝 的 代 表 标 签构成区域，也就是说 Ｄ１代 表 基 因 组 中 单 拷 贝 的 标 签 区域。那么基因组大小
＊ 基金项目：国 家 自 然 科 学 基 金 重 点 项 目 （３１１３００５４）；国 家 基 础 研 究 发 展 计 划 项 目 （２０１０ＣＢ１２６４０２）；国 家 高 技 术 研 究 发 展 计 划 项 目 （２０１２ＡＡ１０Ａ４０５）；教 育 部 新 世 优 秀 人 才 支 持 计 划 项 目 （ＮＣＥＴ－１０－０７６１）资 助
ｍ＝２ 或 ３ 是 最 佳 点，例 如 ｍ ＝２，Ｃ＝１０ 时 ｑ＝ ９２％ 左 右 。
２．２ 重复序列的影响 基因组中存 在 着 大 量 的 重 复 序 列，而 且 处 于 重 复
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中 国 海 洋 大 学 学 报
２ ０ １ ３ 年
重复序列内 的 ＳＮＰ 一 般 是 在 分 型 的 过 程 中 要 排 除 掉 的，因为在用于 群 体 遗 传 学 分 析 或 遗 传 图 谱 的 构 建 时 这样的 ＳＮＰ 在 基 因 组 中 的 位 置 的 不 确 定 使 得 无 法 进 行后续的分析。在简化的基因组中
目前 针 对 基 于 该 系 列 新 技 术 进 行 ＳＮＰ 分 型 和 筛 查过程中的测序错误和重复序列的影响的研究更多的 体现在对数据的分析验 证 上。 华 大 基 因 Ｄｕ 等 深 ［１１］ 入 的研究 了 ＲＲＬｓ技 术 开 发 ＳＮＰ 的 可 靠 性，用 Ｔｓｐ ４５１ 酶 切 人 类 基 因 组 进 行 ＳＮＰ 分 型 的 假 阳 性 率 为 １３．９５％，假阴性率 为 ２５．９％，认 为 碱 基 的 测 序 质 量 值 和重复序列的存在分别是造成假阳性率和假阴性率高 的主要 原 因。Ｈｏｈｅｎｌｏｈｅ 利 ［１２］ 用 ＲＡＤ－ｓｅｑ 技 术 开 发 斑马鱼 ＳＮＰ 标记过程 中 利 用 模 拟 数 据 分 析 了 ＳＮＰ 分 型的可靠性，发现测序错误率较高 时，５１％ 的“堆”是 虚 假的，而且 ＳＮＰ 分型的准确率只有８０％左右。
（中国海洋大学 １．海洋生命学院海洋生物遗传育种教育部重点实验室 ，山东 青岛 ２６６００３；２．数学科学学院，山东 青岛 ２６６１００）
摘 要： 单核 苷 酸 多 态 性 （Ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ—ＳＮＰ）被 认 为 是 揭 示 遗 传 变 异 理 想 的 分 子 标 记 ，近 几 年 来 一 系列针对高通量测序平台的技术如 ＲＡＤ，ＧＢＳ，ＲＲＬｓ，２ｂ－ＲＡＤ 等成为非模式生物尤其是水生动物的 ｄｅ ｎｏｖｏ ＳＮＰ 标 记 规 模开发和大 样 本 群 体 遗 传 研 究 的 有 利 途 径 。本 文 从 理 论 上 讨 论 了 测 序 错 误 和 重 复 序 列 因 素 对 ｄｅ ｎｏｖｏ ＳＮＰ 分 型 的 影 响， 并利用模式生物拟南芥 ＲＡＤ 模拟数据对理论分析进行了验证。通过理论推导和模拟验证发现测序数据 量 在 １５～２０Ｘ 左 右时单拷贝区域内 ＳＮＰ 被检测的概率大于９５％，等位基因的支持度不小 于 ２ 时 能 够 有 效 屏 蔽 掉 测 序 错 误 对 ＳＮＰ 分 型 的 影响（假阳性低于２％），这些为实际数据的 ｄｅ ｎｏｖｏ ＳＮＰ 分型提供了理论上的指导。 关键词： ｄｅ ｎｏｖｏ ＳＮＰ 分型；测序错误；重复序列 中 图 法 分 类 号 ： Ｓ９１７ 文 献 标 志 码 ： Ａ 文 章 编 号 ： １６７２－５１７４（２０１３）０５－１２０－０５
收 稿 日 期 ：２０１２－０１－１１；修 订 日 期 ：２０１２－１０－２０ 作 者 简 介 ：窦 锦 壮 （１９８７－），男 ，博 士 生 。Ｅ－ｍａｉｌ：ｔｈｉｎｋｈｉｇｈｌｙ＠１６３．ｃｏｍ ＊＊ 通讯作者：Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｗａｎｇ＠ｏｕｃ．ｅｄｕ．ｃｎ
５期
窦锦壮，等：测序错误和重复序列对 ｄｅ ｎｏｖｏ ＳＮＰ 分型的影响
Ｐ（ｋ｜Ｃ）＝Ｃｋｋｅ！－Ｃ 。
表 １ 文 中 常 用 符 号 说 明 Ｔａｂｌｅ １ Ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｍｂｏｌｓ
符号 Ｓｙｍｂｏｌ
含义 Ｍｅａｎｉｎｇ
ε
测序错误率
ｈ
基因组杂合率即某个位点是 ＳＮＰLeabharlann Baidu的概率
ｄ
覆盖基因组中某一位置的所有序列条数
ｍ
ＳＮＰ 位点中等位基因频率比较低的覆盖深度
之一是有些 ＳＮＰ 位 点 因 为 低 频 等 位 基 因 深 度 ｎ２ ＜ｍ （测序不均匀导 致 ）而 不 能 够 进 行 分 型，这 就 造 成 了 假
阴性。（３）式给出了 低 频 等 位 基 因 深 度 ｍ 下 单 拷 贝 区
域内 ＳＮＰ 能够被分型的概率表达式推导如下
Ｐ（ｎ２ ＜ｍ，ｎ１ ≥ｍ｜ＡＴ）＝１－Ｐ（ｎ２ ≥Ｍ ，Ｎ１ ≥ｍ｜ＡＴ）＝ １－Ｐ（ｎ２ ≥ｍ｜ＡＴ）Ｐ（ｎ１ ≥ｍ｜ＡＴ）＝１－ ｛Ｐ（ｎ≥ｍ｜ ＡＴ）｝２，
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度下测序错误 和 重 复 序 列 的 综 合 影 响，并 利 用 了 拟 南 芥 ＲＡＤ－Ｓｅｑ模拟数据进行了验证。
１ Ｄｅ ｎｏｖｏ ＳＮＰ 分型原理
４种 碱 基 字 母 集 合 ∑ ＝ ｛Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ｝，对 于 二 倍
体物 种 而 言 由 于 有 ２ 套 单 倍 染 色 体 Ｌ１，Ｌ２，不 妨 记 ＤＮＡ 信息 Ｌ１ ＝ａ１ａ２ …ａｋ …ａＮ ，Ｌ２ ＝ｂ１ｂ２ …ｂｋ …ｂＮ （ａｋ，
的假阴 性。（２）基 因 组 中 重 复 序 列 的 存 在 。 ［８］ 当 有 参 照基因组时，短的序列可以直接比 对 到 基 因 组 上，处 于 重复序列区域的就会出现“一对多”的情 况，当 做“候 选 多拷贝序列”而被过滤掉［９］。ｄｅ ｎｏｖｏ ＳＮＰ 分型则需 要 ３０～１００ｂｐ的序列进 行 “聚 类”。 此 时 处 于 基 因 组 中 不 同位置的序列 可 能 会 聚 在 一 起，因 而 产 生 大 量 假 阳 性 ＳＮＰ［１０］。
ｂｋ∈ ∑ ）。
ＳＮＰ 位点定义 为 （ａｋ，ｂｋ）｜ａｋ ≠ｂｋ，在 分 型 时 所 产 生的测序数据 是 短 的 含 有 特 定 序 列 结 构 的 标 签，因 此 从标签的角度来看 Ｌ１＝ｃ１Ｎ１ｃ２Ｎ２…ｃｋＮｋ…ｃｎ，Ｌ２＝ｄ１Ｎ１ｄ２Ｎ２…ｄｋＮｋ…ｄｎ， 其中ｃｋ（ｄｋ）是 长 度 为ｌ 的 含 有 特 定 结 构 序 列 标 签；Ｎｋ 是任意长度的序列片段。通过 ＲＡＤ－Ｓｅｑ技术后可以 得到简化的基因组 Ｌ′１＝ｃ１ｃ２…ｃ…ｃｎ，Ｌ′２＝ｄ１ｄ２…ｄｋ…ｄｎ， 生成的测序数据集 Ｄ＝｛ｃ１…ｃ１，ｃ２…ｃ２，…，ｃＮ ，ｄ１…ｄ１，ｄ２…ｄ２，…，ｄＮ …ｄＮ ｝， 标 签 在 测 序 数 据 集 中 的 数 目 服 从 泊 松 分 布 ［１４］
图１ 测序错误和重复序列对 ｄｅ ｎｏｖｏ ＳＮＰ 分型影响示意图 Ｆｉｇ．１ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｅｒｒｏｒ ａｎｄ ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｎ
ｄｅ ｎｏｖｏ ＳＮＰ ｃａｌｌｉｎｇ
从图１中可以看出测序错误所产生的假阳性 ＳＮＰ 的特点是最小等位基 因 支 持 度 ｍ 较 小，重 复 序 列 区 域 内的 ＳＮＰ 的特点是ｃｌｕｓｔｅｒ深度ｄ 较高。
２ 测序错误和重复序列对 ＳＮＰ 分型影响
２．１ 测序错误的影响 假设 测 序 平 均 深 度 为 Ｃ，测 序 错 误 率 为ｅ，如 果 观
测到某位点的低频等位基因深度为 ｍ 那么杂合位点与
纯和位点概率之比
（ ） ｒ＝ＰＰ（（ｎｎ２２＝＝ｍｍ｜｜ＡＡＴＡ））＝Ｐｒ（ｍε｜ｍＣ／２）＝
Ｃ ２ε
ｍ ｅｍ－Ｃ！／２ 。
针对该新技术进行ｄｅ ｎｏｖｏ ＳＮＰ 分 型 时 关 于 测 序 错误和重复序 列 因 素 影 响 的 理 论 分 析 未 见 报 道，仅 有 文献［１３］针 对 ４５４ 等 技 术 进 行 ＳＮＰ 分 型 时 讨 论 测 序 覆盖度下测序 错 误 和 重 复 序 列 的 各 自 的 影 响，本 文 在 ［１３］的基础上给出了ｄｅ ｎｏｖｏ ＳＮＰ 分型时 不 同 测 序 深
无参照基因组 ＳＮＰ 分型（ｄｅ ｎｏｖｏ ＳＮＰ 分型）在所 研究的物种 的 参 照 基 因 组 缺 乏 的 前 提 下 进 行 ＳＮＰ 的 分型和筛查。近几年来一系列基于高通量测序平台的 “简化基因组”的方法如 ＲＡＤ，ＧＢＳ，ＲＲＬｓ，２ｂ－ＲＡＤ［１－７］ 等成为非模式生物尤其是水生动物 的 ｄｅｎｏｖｏ ＳＮＰ 规 模开发和大样本群体遗传研究的有利途径。这一系列 技术的共同特点是通过限制性内切酶酶切基因组中的 特定序列，来达 到 低 成 本 特 定 目 标 序 列 高 覆 盖 度 的 效 果。由于参照 基 因 组 的 缺 乏，来 源 于 基 因 组 中 相 同 位 置的短序列通 过 聚 类 建 成 堆 （ｃｌｕｓｔｅｒ），然 后 进 行 ＳＮＰ 分型。ｄｅ ｎｏｖｏ ＳＮＰ 分 型 的 数 据 分 析 中 的 ２ 个 困 难： （１）测序错 误 的 干 扰。 高 通 量 测 序 平 台 的 较 高 的 测 序 错误率使得序列的质量值比较低而当做无用序列过滤 掉，这会造成部分等位基 因 的 丢 失 因 而 造 成 ＳＮＰ 分 型
一般情况下，设测序错误率在 Ｃ＝２０，ｍ＝１ 时ｒ＝
６．７４，即分型所得到的 ＳＮＰ 是 杂 合 的 概 率 是 纯 和 概 率 的６．７４ 倍。ｍ ＝２ 时ｒ＝３ ３６９，可 见 ｍ 越 高 理 论 上 ＳＮＰ 的分型可以 基 本 上 排 除 测 序 错 误 的 干 扰，即 所 得
到的杂合位 点 是 真 实 的 ＳＮＰ 而 不 是 由 于 测 序 错 误 导 致的。虽然 ｍ≥２时 可 以 有 效 的 排 除 测 序 错 误 对 杂 合 位点 ＳＮＰ 分型的影响，这 一 条 件 限 制 带 来 的 不 利 结 果