mRNA差别显示技术

mRNA差别显示技术应用的优势： 差别显示技术应用的优势： 差别显示技术应用的优势
第一，实验要求的样品的用量较少（0.1～0.5µg）。 第二，因为此技术程序里包括PCR扩增步骤，因而更灵 敏地用于检测在组织或细胞中表达丰度极低的mRNA样 品的差异表达。 第三，因为从两种或更多的特定组织样品来源的扩增产 物在同一块胶上鉴定，因此能用于鉴定特定组织或细胞 来源样品之间转录水平的mRNA的定性和定量变化。 第四，能够检测那些彼此密切相关的RNA分子之间的表 达方面的差异，而这种RNA分子的有些种类在构建消减 cDNA文库时已经丢失。
mRNA差异显示技术现在已经成功运用于动物的胚胎 发育、组织分化、生长因子激活与抑制、细胞周期控 制、癌变及疾病相关基因的鉴定和克隆 癌变及疾病相关基因的鉴定和克隆，在植物无 癌变及疾病相关基因的鉴定和克隆 性繁殖、形态发生、次生代谢、抗逆抗病等方面被用 来进行基因的鉴定、克隆以及功能研究，并取得很好 的结果。概括起来其主要用途可以归纳为以下三点： 第一，寻找差异表达的基因。 第二，研究个体、种群或品种间转录水平上的遗传变 异。 第三，鉴定经济动物中控制重要数量经济性状位点的 基因。
二、基本概念： 基本概念：
1、mRNA 差别显示 技术： 技术：
1992 年，Liang 和Padee 建立了以 PCR 为基础的mRNA 差异显示技术 （differential display reverse transcription polymerase chain reaction, DDRT-PCR DDRT-PCR）。它是将 mRNA反转录技术与PCR技术二者相 RNA指纹图谱 互结合发展起来的一种RNA指纹图谱 技术。目前已广泛应用于分离鉴定组 技术 织特异性表达的基因。
mRNA差别显示技术 RNA差别显示技术
Jeffreys等用肌红蛋白基因的一个内含子 的串联重复序列作探针，从人的基因文 库中筛选出8个含有串联重复序列的重组 克隆。序列分析表明，这8个小卫星重复 单位的长度和序列不完全相同，但都有 相同的核心序列，他们先后用两个小卫 星探针进行Souther杂交，在低严谨条件 下杂交图谱的带型千差万刷，如人的指 纹一样．Jeffreys称之为DNA 指纹或遗传 指纹。
6、基因芯片技术： 基因芯片技术：
基因芯片技术也称DNA微阵列技术（DNA microarray) ， 实际上就是一种大规模集成的固相杂交 模集成的固相杂交，是指在固相 模集成的固相杂交 支持物上原位合成(in situ synthesis)寡核苷酸或者直接 将大量预先制备的DNA探针 DNA探针 探针以显微打印的方式有序地 固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交。通过对 杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息 基因序列 遗传信息(基因序列 遗传信息 及表达的信息)。由于常用计算机硅芯片作为固相支持 及表达的信息 物，所以称为DNA芯片。
DNA指 DNA指 纹
DNA指纹图
图为41个红花檵木品种嫩叶DNA，红花檵 木为我国特产的一种优良园林绿化观赏植物
DNA指纹的应用： DNA指纹的应用： 指纹的应用
在80年代中期兴起DNA指纹技术和 RNA指纹技术．目前此技术已广泛应用 于遗传育种 基因鉴定 连锁分析 罪 遗传育种、基因鉴定 连锁分析、罪 遗传育种 基因鉴定、连锁分析 犯鉴别、疾病早期诊断 基因调控等方 疾病早期诊断、基因调控 犯鉴别 疾病早期诊断 基因调控 面的研究。
9、双向电泳技术
双向电泳（ 双向电泳（two-dimensional electrophoresis）是等 ） 电聚焦电泳和 电聚焦电泳和SDS-PAGE（十二烷基磺酸钠 聚丙烯 （十二烷基磺酸钠—聚丙烯 酰胺凝胶电泳）的组合， 先进行等电聚焦电泳（ 酰胺凝胶电泳）的组合，即先进行等电聚焦电泳（按 分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大 照pI分离），然后再进行 分离），然后再进行 （ ），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图 经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。 小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。 第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离 梯度分离， 第一向进行等电聚焦，蛋白质沿 梯度分离，至各自 的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离. 的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离
mRNA差异显示PCR技术是1992年建立起来的一种 RNA指纹 RNA指纹 指纹技术,是目前筛选差异表达基因最有效的方 法,可以提供生理状态下细胞的即时信息,揭示基因调 揭示基因调 控在RNA水平的结果,它通过比较细胞对某一因素作 控在RNA水平的结果 用前后在RNA水平的差别,确定在基因水平上细胞对 某些因素作用后的分子机制。
mRNA差别显示技术 RNA差别显示技术
生物技术二班 方玉兵 09111082
mRNA差别显示技术 RNA差别显示技术
主要内容
一、概述 二、基本概念 三、基本原理 四、实际应用
一、概述：mRNA差别显示技术 概述： RNA差别显示技术
高等生物大约有3~5 万个不同的基因，在每一个正常的体细 胞中都含有相同的基因组拷贝，但在不同的组织细胞中仅有 10%~20%的少部分基因被选择性表达 选择性表达，这种选择性表达是在发 选择性表达 育过程中细胞分化的根本原因，是调控细胞生命活动过程的核心 机制。因此，比较不同组织之间，或相同组织在不同生理条件下， 或胚胎在不同的发育阶段的基因表达差异，可分离并克隆出这些 特异性表达的基因。近年来，该领域的研究取得了很大进展， 扣除杂交（subtractive hybridization, SH）、基因芯片技术 （DNA chip technique）、基因表达的系统分析(serial analysis of gene expression, SAGE)、噬菌体全套抗体库技术(phage display antibody repertoire library technique)和双向电泳技术 双向电泳技术 (two-dimensional gel electrophoresis)先后成功地建立。
差异显示技术的原理： 三、mRNA差异显示技术的原理： 差异显示技术的原理
利用所有真核基因的mRNA 的3’端都有一段多聚腺苷酸 poly(A)尾结构的特点，将不同来源的总mRNA反转录合成 cDNA,此cDNA 合成是采用oligo(dT)12MN 为引物，其中M为 A,C,G中的任意一种，N为A,C,G 或T 中的任意一种，共有 12 种oligo(dT)12MN 引物 oligo(dT)12MN 引物，其中M为锚定碱基 M为锚定碱基可增大引物 的Tm值，N 称为分类碱基 N 称为分类碱基，对反转录进行分类。用这12 种 引物分别对同一总mRNA 样品进行cDNA 合成 进行cDNA 合成，即进行12 次 进行 不同的反转录反应，得到12种类型的cDNA，从而也将总 mRNA分为12 个亚群。在此基础上对每一类cDNA进行随机引 物和相应的反转录引物PCR扩增 PCR扩增 PCR扩增，由于扩增的cDNA片段被放 射性同位素标记，因而利用放射自显影技术通过对不同组 织样品的同一类cDNA 的PCR 选择性扩增产物进行凝胶电泳 分析，从而反映出不同样品间基因的时间和空间上的组织 反映出不同样品间基因的时间和空间上的组织 特异性的表达。 特异性的表达。
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mRNA差异显示技术简略流程图
放射性自显影技术的概念： 放射性自显影技术的概念：
放射性自显影法与普通照相的曝光、显影、定影 放射性自显影法 原理相似，此法是利用放射性同位素所放出之射 利用放射性同位素所放出之射 线使照相乳胶“感光”，再经显影和定影处理， 线使照相乳胶“感光” 将乳胶中因受辐照而致敏的卤化银颗粒还原成金 属银，洗去未“感光”的卤化银后则图像自然显 示出来。图像中任何区域的黑度取决于留存的金 属银的量，它反映了射线在这个区域所沉积的能 量。记录、检查和测量整体和组织、细胞和亚细 胞水平中放射性示踪物的分布、进行定性和半定 量测定，称为放射自显影法。
8、噬菌体抗体库技术
以噬菌体(主要是丝状噬菌体、λ噬菌体和T4噬菌体)为 载体,将抗体基因插入噬菌体编码的外壳蛋白基因PⅢ或 PⅥ中,在噬菌体表面以抗体－外壳蛋白融合蛋白的形成 表达。经辅助病毒感染后,借助蛋白PⅢ的信号肽穿膜作 用,进入宿主外周基质,在正确折叠后被包装于噬菌体尾 部,随后携带表达载体的宿主菌就会释放出带有抗体片 段的噬菌体颗粒。此抗体可以特异性识别抗原,又能够 感染宿主菌进行再扩增,将B细胞全套可变区基因克隆 B 出来,组装成噬菌体抗体的群体, 出来,组装成噬菌体抗体的群体,则成为噬菌体抗体库技 术。
4、基因差异表达： 基因差异表达：
基因表达调控的一种方式。 基因表达调控的一种方式。指 在对信号或诱导物做出应答时， 在对信号或诱导物做出应答时， 选择表达不同的基因， 选择表达不同的基因，或使基 因的表达水平有所不同。 因的表达水平有所不同。
5、基因扣除技术： 基因扣除技术：
也称扣除 扣除cDNA克隆 克隆(subtractive cDNA cloning)，它 扣除 克隆 是通过构建扣除文库(subtractive library)得以实现的 。本 质是除去那些普遍共同存在的、或是非诱发产生的 除去那些普遍共同存在的、 除去那些普遍共同存在的 或是非诱发产生的cDNA 序列，从而使欲分离的目的基因的序列得到有效的富集， 序列，从而使欲分离的目的基因的序列得到有效的富集， 提高了分离的敏感性。 提高了分离的敏感性 换句话说，也就是我们在提取低风度的mRNA或者其 cDNA时是比较困难的，那么我们不用直接去提取我们的 目的DNA，而是通过除去体系的其他DNA，最终达到留 下我们所需DNA的目的。
每种技术的诞生都不可能是完美的， 每种技术的诞生都不可能是完美的，mRNA差异显示技 差异显示技 术虽然从创立时起就很受欢迎， 术虽然从创立时起就很受欢迎，但是许多研究者发现该 技术存在一定缺陷，其中三点较为突出： 技术存在一定缺陷，其中三点较为突出： 第一，操作步骤多，外源DNA污染严重而导致假阳性率 假阳性率 高，即差异片断用Northern杂交时无阳性信号，重复稳定 性较差。据研究，这种假阳性率可高达70％ 第二，获得的差异条带短小，多为300bp左右，并且多为 3’端非编码区序列（UTR），难以直接判断其功能和意义。 第三，必须采用放射性同位素标记反应，使得实验周期长、 成本高、易造成同位素污染，且不好回收差异片断。
对mRNA差别显示技术的展望： mRNA差别显示技术的展望 差别显示技术的展望：
由于人们认识的基因还不够全面，特别是对生物发生、发 育及病理生理过程中某些新的功能基因和调控作用认识不足， 因此差异显示技术将在研究生物进化、损伤修复、癌变及治疗 反应过程中具有重要意义。差显技术的发现为在该领域中寻找 新基因提供了有用的工具。相信随着不断的应用和技术的不断 改善，差异显示技术必越来越多的在生命科学以及医学领域的 基因鉴定、克隆等方面起到更大的作用，对揭示生物界基因表 达调控的奥秘将起重要作用。 经过近几年的研究，在提高重复性，降低假阳性方面有所改 进，尤其mRNA 差异显示试剂盒的商品化，为mRNA 差异显示 提供了成套试剂，mRNA 差异显示技术将会越来越广泛的应用 于生命科学的研究。对进一步揭开基因表达调控的奥秘，将发 挥越来越大的作用。
2、RNA指纹： RNA指纹 指纹：
RNA 首先在逆转录酶的作 用下使RNA 逆转录为DNA， 之后以其DNA 为模板，通过 以DNA指纹 DNA指纹 指纹技术建立指纹图 指纹图 谱进行分析。
3、DNA指纹： DNA指纹 指纹：
某些DNA序列的差异可通过限制性酶切 限制性酶切 片段长度的改变反映出来，此即限制性片段 片段 长度多态性(RFLP) (RFLP)。其主要原因是由于DNA 序列个别碱基的突变而引起某个限制性内切 酶识别位点的获得或丢失，表现为不同长度 的酶切片段．
基因芯片
7、基因表达系列分析 、
基因表达系列分析（SAGE）是通过快速和详 快速和详 细分析成千上万个EST（express sequenced 细分析成千上万个 tags）来寻找出表达丰富度不同的SAGE标签序 列。在此方法中，通过限制性酶切可以产生非 常短的cDNA（10-14bp）标签，并通过PCR扩 增和连接，随后对连接体进行测序。SAGE大 大简化和加快了3’端表达序列标签的收集和测 序.