基因工程的酶学基础

如 R.Hind Ⅲ表示限制性内切酶 M.Hind Ⅲ 表示相应的甲基化酶
实际应用中，R常被省略。
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三、限制性内切酶的类型
目前鉴定出四种不同类型的限制性内切酶。主要的 三种：
Ⅰ 型限制性内切酶 Ⅱ 型限制性内切酶
Ⅲ 型限制性内切酶
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1. Ⅰ型限制性内切酶的基本特性
首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。
与DNA的来源无关，即没有种的特异性。
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稀有切割限制酶（rare cutter） 可以识别6个以上的核苷酸序列的少 数的限制内切酶。
如Not I （GCGGCCGC）
某些限制性内切酶的识别序列中，某一个或两个 碱基并非严格专一。
如Hind Ⅱ可识别4种核苷酸序列：
5
GTYRAC
-3’
’ Y: C或T
1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3 个字母的略语表示寄主菌的物种名，组成酶的基 本名称。
大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示
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2. 如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株 名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因 位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母 表示此染色体外遗传成分。
5’-
CTGCAG
-3’
3’-
GACGTC
-5’
5’-
CTGCA
G
-3’
3’-
G
ACGTC
-5’
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[2] 粘性末端的意义
① 连接便利
i）不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 这比连接两个平齐末端容易得多。
ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环 形分子。
1-1.5kb
需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）
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2. Ⅱ类限制性内切酶的基本特性
首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从 流感嗜血菌中分离出来。
分离的第一个酶是Hind Ⅱ
基因工程用途最大
（1）识别位点序列
未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数 是呈典型的旋转对称型的回文结构）。
3. 功能 自我保护作用
细菌的限制和修饰系统（R/M体系）
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（1）限制（Restriction）
限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA 进行分解，切成小片断。
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（2）修饰（Modification）
细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所 保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。 ① Dam甲基化酶(DNA Adenine Methylase)
如 EcoB和 EcoK。
（1）识别位点序列
未甲基化修饰的特异序列。
EcoB： TGA(N)8TGCT
EcoK：AAC(N)6GTGC
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（2）切割位点
在距离特异性识别位点约1000—1500 bp处随 机切开一条单链，不产生特异片断，应用不大
Recognize site
cut
（3）辅助因子
第二章 基因工程的酶学基础
Enzymes
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本章节内容
第一节 限制性核酸内切酶 第二节 DNA连接酶 第三节 DNA聚合酶 第四节 DNA修饰酶 第五节 核酸外切酶 第六节 单链核酸内切酶
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本章学习内容
重点讨论限制性核酸内切酶和DNA连接酶在 DNA切割和连接中的应用，并简要介绍其他 与基因克隆有关的其它的重要的酶。
如 Hind Ⅱ：d菌株 EcoR I ：抗药性R质粒
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3. 如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修 复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的 先后次序。
如Hind Ⅱ：d菌株中发现的第二个酶
4. 所有的限制酶，除以上名称外还要冠以系统名 称。限制性内切酶的系统命名为R，甲基化酶为M。
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第一节 限制性核酸内切酶
一、限制性核酸内切酶 （Restriction endonuclease） 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特 定核苷酸序列，并由此处切割DNA双链的 核酸内切酶。
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1. 来源 主要来源于原核生物
2. 性质 内切酶
即在核酸分子链的内部制造切口的酶。 形成5’-P和3’-OH末端
GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基
② Dcm甲基化酶(DNA cytosine Methylase) CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上 引入甲基
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（3）限制与修饰系统相关的三个基因
① hsd R: 编码限制性内切酶
这类酶能识别DNA分子上的特定位点，并将双 链DNA切断
② hsd M: 编码限制性甲基化酶
这类酶使DNA分子特定位点上的碱基甲基化， 即起修饰 DNA的作用。
③ hsd S: 编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达
作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。
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二、限制性内切酶的命名
1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统， 命名原则如下：
R: A 或G
-
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（2）切割位点
识别位点处
切开双链DNA，形成粘性末端（sticky end）或 平齐末端（blunt end）。如：
EcoR I 5’-GAATTC-3’ EcoR V
3’-CTTAAG-5’
5’-GATATC-3’ 3’-CTATAG-5’
Pst I
3’
5’
5’-CTGCAG3’-GACGTC-
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② 末端标记
A 末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。 B 末端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸 的尾巴（如dA和dT），即同聚物加尾造成人工粘 性末端。
③ 补平成平齐末端
粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。
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[3] 平齐末端（blunt end）
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产生平齐末端
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[1] 粘性末端（sticky ends，cohensive ends）
含有几个核苷酸单链的末端。 分两种类型：
ⅰ） 5’端凸出（如EcoR I切点）
5’3’-
GAATTC CTTAAG
-3’ -5’
5’3’-
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G
AATTC
CTTAA
G
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-3’ -5’
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ⅱ） 3’端凸出（如Pst I切点）