基因沉默
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1. 根据载体的已知序列设计3 个源自文库其边界距离不等的嵌套 的特异性引物, 长度约20 bp , Tm 一般为58～68 ℃。 2. 按照物种普遍存在的蛋白质的保守氨基酸序列设计一系 列简并引物, 长度为14 bp , Tm 为30～48 ℃。 3. 为了增加简并引物与目标序列间退火的可能性,除了3′ 端的3 个碱基以外,其它位置的碱基包含简并核苷酸。特 异性引物和简并引物的选择直接影响扩增的效果。如果 不能获得满意的扩增结果,则应该在预备实验中重新设 计特异性引物或者换用其它的简并引物。
如图： 有一个a 如图：MAT有一个a或α的 活性盒（active 活性盒（ cassette）； HML和 ）；而 cassette）；而HML和 HMR基因座有沉默盒 基因座有沉默盒（ HMR基因座有沉默盒（ cassette）。 silence cassette）。 携带α盒子， 通常HML携带α盒子， HMR携带a盒子。所有盒 携带a盒子。 子都携带有编码接合型 的信息， 的信息，但只有位于活 性MAT基因座位点的盒 才能表达。当活性盒所 才能表达。 表达的信息被沉默盒所 取代时， 取代时，接合型就发生 了改变。 了改变。
二、TAIL二、TAIL-PCR 技术的原理
• 利用目标序列旁的已知序列设计 3 个嵌套的特异 性引物( specialprime,简称sp1,sp2,sp3,约20bp) ,用它们分别和1个具有低 Tm 值的短的(14bp)随 机简并引物(Arbi2trarydegenerate prime 简称 AD)相组合 ,以基因组DNA作为模板 ,根据引物的 长短和特异性的差异设计不对称的温度循环 ,通 过分级反应来扩增特异引物。
三、TAIL-PCR 反应步骤
反应： 第1 次PCR 反应： 由5 次高特异性反应、1 次低特异性反应、10 次较低特异性反应和12 次热不对称的超级循环 构成。通过5 次高特异性的反应,使sp1 与已知的 序列(载体或T2DNA 等) 退火并延伸,提高目标序 列的浓度。1 次低特异性的反应使简并引物结合 到较多的目标序列上,10 次较低特异性的反应使 两种引物均能与模板退火,随后进行12 次TAIL 循 环。经过上述反应得到了不同浓度的3 种类型的 产物:特异性产物( Ⅰ型) 和非特异性产物( Ⅱ型和 Ⅲ型) 。
应用
1.抗肿瘤策略 1.抗肿瘤策略
Milner教授应用RNAi技术特异性地 Milner教授应用RNAi技术特异性地 教授应用RNAi 成功沉默了感染HPV HPV的宫颈癌细胞中的 成功沉默了感染HPV的宫颈癌细胞中的 HPV基因 宫颈细胞内的V53 RB蛋白恢 基因, V53和 HPV基因,宫颈细胞内的V53和RB蛋白恢 复正常功能, 复正常功能,从而恢复了宫颈细胞内正 常的防御功能。
Silencer Mating type (MAT) of yeast
3# HML MAT HMR
α
?
a
Silencer can act at a distance (at least 1 kb away) to modulate transcription somehow cause the chromatin to coil up into a condensed Inaccessible Inactive form thereby preventing transcription of neighboring genes
Sir1Sir1Sir1
ORC
Sir1Sir1Sir1
ars
Sir4
Sir2
Sir4
Sir3
Sir3 Sir2
Sir4 Sir复合体 Sir2 Sir3
Sir1
I
沉默 HMR
ORC RAP1 ORC RAP1 结合 位点
E
ABF1
ORC-复制起点识别复合物 RAP1-结合位点阻抑激活蛋白1 ABF1-结合位点和自主复制序列因子1 Sir-沉默信息调节因子
RNAi技术在功能基因组中的应用 RNAi技术在功能基因组中的应用 在功能基因组研究中, 在功能基因组研究中,需要对特定基因进行功能丧失或 降低突变,以确定其功能。由于RNAi具有高度的序列专一性, RNAi具有高度的序列专一性 降低突变,以确定其功能。由于RNAi具有高度的序列专一性, 可以特异地使特定基因沉默,获得功能丧失或降低突变, 可以特异地使特定基因沉默,获得功能丧失或降低突变,因此 RNAi可以作为一种强有力的研究工具 可以作为一种强有力的研究工具, RNAi可以作为一种强有力的研究工具,用于功能基因组的研 究。 RNAi技术在法医学中的应用 RNAi技术在法医学中的应用 法医学的基础研究领域中还面临许多问题至今还未能很 好解决,如脑损伤机制的研究、猝死疾病机制的研究、 好解决,如脑损伤机制的研究、猝死疾病机制的研究、基因 表达、成瘾机制的研究等，RNAi给我们提供了新的思路 给我们提供了新的思路。 表达、成瘾机制的研究等，RNAi给我们提供了新的思路。 RNAi技术在法医学中的应用能为法医学的基础研究带来新的 RNAi技术在法医学中的应用能为法医学的基础研究带来新的 飞跃。 飞跃。
谢 谢 观 赏！
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@WPS官方微博 @kingsoftwps
为什么结构相同只有MAT的Y区域才能表达，而HML 区域才能表达， 表达受抑制？ 和HMR表达受抑制？ 缺失分析表明HMR和HML的两端序列是抑制它们自身 活性所必需的，它们被称为沉默子（silencer）。 ）。位于 活性所必需的，它们被称为沉默子（silencer）。位于 基因盒左端的位点为E沉默子，右端则为I沉默子。 基因盒左端的位点为E沉默子，右端则为I沉默子。 沉默子的作用可能由于几个基因的突变而消失， 沉默子的作用可能由于几个基因的突变而消失，从 的表达。首先被发现的是4 而导致HMR和HML的表达。首先被发现的是4个沉默信息 调控(silent regulation，SIR） 调控(silent information regulation，SIR）基因座 个基因座任何一个位点突变， 。这4个基因座任何一个位点突变，使得HMR和HML能够 被转录。 被转录。 和编码组蛋白H4 H4的 维持沉默的其它基因座包括RAP1和编码组蛋白H4的 基因。 基因。
沉默信息调控可能 是SIR蛋白通过作用于染 色质结构阻止基因的表达 。 每个沉默子都有一个 复制起始点序列ARS，ARS 上则结合有负责复制起始 的起始点识别复合物ORC 。在ORC基因内的突变能 阻止沉默， 阻止沉默，说明ORC蛋白 和沉默子结合是沉默所必 需的。 需的。 ORC的作用只是引入 ORC的作用只是引入 Sir1蛋白 蛋白。 Sir1蛋白。而对于起始复 制并不是必需的。 制并不是必需的。
2.抗病毒 2.抗病毒
斯坦福医学院的研究者把dsRNA 斯坦福医学院的研究者把dsRNA 放进小鼠的肝胞,dsRNA ,dsRNA被小鼠体内 放进小鼠的肝胞,dsRNA被小鼠体内 的核酸酶分解成许多siRNA siRNA， 的核酸酶分解成许多siRNA，研究发 siRNA具有高度专一性 具有高度专一性, 现siRNA具有高度专一性,会与小鼠 体内的丙型肝炎病毒的mRNA相结合, mRNA相结合 体内的丙型肝炎病毒的mRNA相结合, mRNA分解并失去翻译蛋白质的功 使mRNA分解并失去翻译蛋白质的功 能。斯坦福医学院运用此技术来治 疗丙型肝炎的研究, 疗丙型肝炎的研究,已从体外试管实 验阶段推进至体内的动物实验， 验阶段推进至体内的动物实验，且 在小鼠身上, 在小鼠身上,看到丙型肝炎病毒被阻 断的明显效果 明显效果。 断的明显效果。
• 酵母接合型是由MAT基因座上的等位基因类型 MATa和MATα来确定 MATα • 改变接合型的信息是有另外两条基因HMLα和 HMLα HMRa负责的，分别负责MATα和MATa。这些基 负责的， MATα MATa。 基因座位于用一条染色体上， 因和MAT基因座位于用一条染色体上，HML位 于左边远端， 位于右边远端。 于左边远端，HMR位于右边远端
沉默子
Silencer
bua
目录
1. 酵母接合型活性基因座 2. 沉默子在酵母中沉默作用及组成 Tail3. Tail-PCR
enhencer
silencerr
silencing
Silencer Mating type (MAT) of yeast
3# HML MAT HMR
α
?
a
Silencer can act at a distance (at least 1 kb away) to modulate transcription somehow cause the chromatin to coil up into a condensed Inaccessible Inactive form thereby preventing transcription of neighboring genes
一种DNA侧翼序列分离技术 一种DNA侧翼序列分离技术 DNA ———TAIL TAIL———TAIL-PCR
一、TAIL-PCR简介
TAIL-PCR是热不对称交错PCR （Thermal Asymmet ric Interlaced PCR）的简称，它是一种用来 分离与已知序列邻近的未知DNA序列的分子生物学技术 。该技术的问世,能够简易而有效地从已知序列中分离 到其邻近的未知侧翼序列,解决有关基因操作的一系列 难题。 目前已成功地从P1 、YAC 和BAC 克隆中分离获得 插入末端的DNA 序列和拟南芥( A rabidopsis thaliana L. ) 的T-DNA 侧翼序列。此外,经过改良的TAIL-PCR 技 术能够快速克隆Pal 及Pgi 基因的启动子序列和野油菜 黄单胞菌群体感应信号基因。
第2 次反应 将第一级反应的产物稀释100倍作为模板,通过 10 次热不对称的超级循环,使特异性的产物被选 , 择性地扩增,而非特异性的产物被压制到极低的 , 含量。 第3 次反应 将第2 次反应的产物稀释1 00 倍作为模板,一 般设置为普通的PCR 反应或热不对称的超级循 环。通过上述3 次PCR 反应可获得与已知序列邻 近的目标序列。
在TAIL-PCR 反应中,高特异性循环的退火温 度设为65 ℃左右,较低特异性循环的退火温度设 为44 ℃,低特异性循环的退火温度设为25～30 ℃ 。反应体系中,特异性引物的浓度与普通的PCR 相同,简并引物的浓度要高,一般为2. 5～5. 0µmol/ L ,以满足引物的结合效率。
五、TAIL-PCR的引物设计
引 物 1
引 物 2
引 物 3
随即引物
HMR
HMR E
图1
TAIL2PCR反应流程图 反应流程图
图1
TAIL2PCR反应流程图 反应流程图
四、TAIL-PCR的反应条件
• TAIL-PCR 反应 条件在不同的实 验中稍有变化。 在表1 所示的条 件下对P1 和YAC 克隆插入末端序 列的分析中获得 了满意的结果。 这种反应条件亦 是一个规范的实 验设置,可以满足 大多数实验的需 要。
相关概念
半特异性PCR： 半特异性PCR：由一个特异性引物和一个简并 PCR 引物相组合构成的PCR 反应 这种反应会产生3 种不同类型的产物: 这种反应会产生3 种不同类型的产物: (1) 由特异性引物和简并引物扩增出的产物; (2) 由同一特异性引物扩增出的产物; (3) 由同一简并引物扩增出的产物。在TAIL-PCR 反应中,后两种非目标产物可以通过以嵌套的特 异性引物进行的后续反应来消除。
结合型位点的结构 如图。在每个a 如图。在每个a和α 盒中心区域（ 盒中心区域（称Ya 是不同的， 或Yα）是不同的， 而两侧是相同的。 而两侧是相同的。 在中心区域两侧的 序列尽管在HMR中要 短一些， 短一些，但它们是 非常相似的。 非常相似的。在MAT 上的活性盒是从Y 上的活性盒是从Y区 域中的一个启动子 开始转录的。 开始转录的。
如图： 有一个a 如图：MAT有一个a或α的 活性盒（active 活性盒（ cassette）； HML和 ）；而 cassette）；而HML和 HMR基因座有沉默盒 基因座有沉默盒（ HMR基因座有沉默盒（ cassette）。 silence cassette）。 携带α盒子， 通常HML携带α盒子， HMR携带a盒子。所有盒 携带a盒子。 子都携带有编码接合型 的信息， 的信息，但只有位于活 性MAT基因座位点的盒 才能表达。当活性盒所 才能表达。 表达的信息被沉默盒所 取代时， 取代时，接合型就发生 了改变。 了改变。
二、TAIL二、TAIL-PCR 技术的原理
• 利用目标序列旁的已知序列设计 3 个嵌套的特异 性引物( specialprime,简称sp1,sp2,sp3,约20bp) ,用它们分别和1个具有低 Tm 值的短的(14bp)随 机简并引物(Arbi2trarydegenerate prime 简称 AD)相组合 ,以基因组DNA作为模板 ,根据引物的 长短和特异性的差异设计不对称的温度循环 ,通 过分级反应来扩增特异引物。
三、TAIL-PCR 反应步骤
反应： 第1 次PCR 反应： 由5 次高特异性反应、1 次低特异性反应、10 次较低特异性反应和12 次热不对称的超级循环 构成。通过5 次高特异性的反应,使sp1 与已知的 序列(载体或T2DNA 等) 退火并延伸,提高目标序 列的浓度。1 次低特异性的反应使简并引物结合 到较多的目标序列上,10 次较低特异性的反应使 两种引物均能与模板退火,随后进行12 次TAIL 循 环。经过上述反应得到了不同浓度的3 种类型的 产物:特异性产物( Ⅰ型) 和非特异性产物( Ⅱ型和 Ⅲ型) 。
应用
1.抗肿瘤策略 1.抗肿瘤策略
Milner教授应用RNAi技术特异性地 Milner教授应用RNAi技术特异性地 教授应用RNAi 成功沉默了感染HPV HPV的宫颈癌细胞中的 成功沉默了感染HPV的宫颈癌细胞中的 HPV基因 宫颈细胞内的V53 RB蛋白恢 基因, V53和 HPV基因,宫颈细胞内的V53和RB蛋白恢 复正常功能, 复正常功能,从而恢复了宫颈细胞内正 常的防御功能。
Silencer Mating type (MAT) of yeast
3# HML MAT HMR
α
?
a
Silencer can act at a distance (at least 1 kb away) to modulate transcription somehow cause the chromatin to coil up into a condensed Inaccessible Inactive form thereby preventing transcription of neighboring genes
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ORC
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Sir4
Sir2
Sir4
Sir3
Sir3 Sir2
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Sir1
I
沉默 HMR
ORC RAP1 ORC RAP1 结合 位点
E
ABF1
ORC-复制起点识别复合物 RAP1-结合位点阻抑激活蛋白1 ABF1-结合位点和自主复制序列因子1 Sir-沉默信息调节因子
RNAi技术在功能基因组中的应用 RNAi技术在功能基因组中的应用 在功能基因组研究中, 在功能基因组研究中,需要对特定基因进行功能丧失或 降低突变,以确定其功能。由于RNAi具有高度的序列专一性, RNAi具有高度的序列专一性 降低突变,以确定其功能。由于RNAi具有高度的序列专一性, 可以特异地使特定基因沉默,获得功能丧失或降低突变, 可以特异地使特定基因沉默,获得功能丧失或降低突变,因此 RNAi可以作为一种强有力的研究工具 可以作为一种强有力的研究工具, RNAi可以作为一种强有力的研究工具,用于功能基因组的研 究。 RNAi技术在法医学中的应用 RNAi技术在法医学中的应用 法医学的基础研究领域中还面临许多问题至今还未能很 好解决,如脑损伤机制的研究、猝死疾病机制的研究、 好解决,如脑损伤机制的研究、猝死疾病机制的研究、基因 表达、成瘾机制的研究等，RNAi给我们提供了新的思路 给我们提供了新的思路。 表达、成瘾机制的研究等，RNAi给我们提供了新的思路。 RNAi技术在法医学中的应用能为法医学的基础研究带来新的 RNAi技术在法医学中的应用能为法医学的基础研究带来新的 飞跃。 飞跃。
谢 谢 观 赏！
Make Presentation much more fun
@WPS官方微博 @kingsoftwps
为什么结构相同只有MAT的Y区域才能表达，而HML 区域才能表达， 表达受抑制？ 和HMR表达受抑制？ 缺失分析表明HMR和HML的两端序列是抑制它们自身 活性所必需的，它们被称为沉默子（silencer）。 ）。位于 活性所必需的，它们被称为沉默子（silencer）。位于 基因盒左端的位点为E沉默子，右端则为I沉默子。 基因盒左端的位点为E沉默子，右端则为I沉默子。 沉默子的作用可能由于几个基因的突变而消失， 沉默子的作用可能由于几个基因的突变而消失，从 的表达。首先被发现的是4 而导致HMR和HML的表达。首先被发现的是4个沉默信息 调控(silent regulation，SIR） 调控(silent information regulation，SIR）基因座 个基因座任何一个位点突变， 。这4个基因座任何一个位点突变，使得HMR和HML能够 被转录。 被转录。 和编码组蛋白H4 H4的 维持沉默的其它基因座包括RAP1和编码组蛋白H4的 基因。 基因。
沉默信息调控可能 是SIR蛋白通过作用于染 色质结构阻止基因的表达 。 每个沉默子都有一个 复制起始点序列ARS，ARS 上则结合有负责复制起始 的起始点识别复合物ORC 。在ORC基因内的突变能 阻止沉默， 阻止沉默，说明ORC蛋白 和沉默子结合是沉默所必 需的。 需的。 ORC的作用只是引入 ORC的作用只是引入 Sir1蛋白 蛋白。 Sir1蛋白。而对于起始复 制并不是必需的。 制并不是必需的。
2.抗病毒 2.抗病毒
斯坦福医学院的研究者把dsRNA 斯坦福医学院的研究者把dsRNA 放进小鼠的肝胞,dsRNA ,dsRNA被小鼠体内 放进小鼠的肝胞,dsRNA被小鼠体内 的核酸酶分解成许多siRNA siRNA， 的核酸酶分解成许多siRNA，研究发 siRNA具有高度专一性 具有高度专一性, 现siRNA具有高度专一性,会与小鼠 体内的丙型肝炎病毒的mRNA相结合, mRNA相结合 体内的丙型肝炎病毒的mRNA相结合, mRNA分解并失去翻译蛋白质的功 使mRNA分解并失去翻译蛋白质的功 能。斯坦福医学院运用此技术来治 疗丙型肝炎的研究, 疗丙型肝炎的研究,已从体外试管实 验阶段推进至体内的动物实验， 验阶段推进至体内的动物实验，且 在小鼠身上, 在小鼠身上,看到丙型肝炎病毒被阻 断的明显效果 明显效果。 断的明显效果。
• 酵母接合型是由MAT基因座上的等位基因类型 MATa和MATα来确定 MATα • 改变接合型的信息是有另外两条基因HMLα和 HMLα HMRa负责的，分别负责MATα和MATa。这些基 负责的， MATα MATa。 基因座位于用一条染色体上， 因和MAT基因座位于用一条染色体上，HML位 于左边远端， 位于右边远端。 于左边远端，HMR位于右边远端
沉默子
Silencer
bua
目录
1. 酵母接合型活性基因座 2. 沉默子在酵母中沉默作用及组成 Tail3. Tail-PCR
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silencerr
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Silencer Mating type (MAT) of yeast
3# HML MAT HMR
α
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Silencer can act at a distance (at least 1 kb away) to modulate transcription somehow cause the chromatin to coil up into a condensed Inaccessible Inactive form thereby preventing transcription of neighboring genes
一种DNA侧翼序列分离技术 一种DNA侧翼序列分离技术 DNA ———TAIL TAIL———TAIL-PCR
一、TAIL-PCR简介
TAIL-PCR是热不对称交错PCR （Thermal Asymmet ric Interlaced PCR）的简称，它是一种用来 分离与已知序列邻近的未知DNA序列的分子生物学技术 。该技术的问世,能够简易而有效地从已知序列中分离 到其邻近的未知侧翼序列,解决有关基因操作的一系列 难题。 目前已成功地从P1 、YAC 和BAC 克隆中分离获得 插入末端的DNA 序列和拟南芥( A rabidopsis thaliana L. ) 的T-DNA 侧翼序列。此外,经过改良的TAIL-PCR 技 术能够快速克隆Pal 及Pgi 基因的启动子序列和野油菜 黄单胞菌群体感应信号基因。
第2 次反应 将第一级反应的产物稀释100倍作为模板,通过 10 次热不对称的超级循环,使特异性的产物被选 , 择性地扩增,而非特异性的产物被压制到极低的 , 含量。 第3 次反应 将第2 次反应的产物稀释1 00 倍作为模板,一 般设置为普通的PCR 反应或热不对称的超级循 环。通过上述3 次PCR 反应可获得与已知序列邻 近的目标序列。
在TAIL-PCR 反应中,高特异性循环的退火温 度设为65 ℃左右,较低特异性循环的退火温度设 为44 ℃,低特异性循环的退火温度设为25～30 ℃ 。反应体系中,特异性引物的浓度与普通的PCR 相同,简并引物的浓度要高,一般为2. 5～5. 0µmol/ L ,以满足引物的结合效率。
五、TAIL-PCR的引物设计
引 物 1
引 物 2
引 物 3
随即引物
HMR
HMR E
图1
TAIL2PCR反应流程图 反应流程图
图1
TAIL2PCR反应流程图 反应流程图
四、TAIL-PCR的反应条件
• TAIL-PCR 反应 条件在不同的实 验中稍有变化。 在表1 所示的条 件下对P1 和YAC 克隆插入末端序 列的分析中获得 了满意的结果。 这种反应条件亦 是一个规范的实 验设置,可以满足 大多数实验的需 要。
相关概念
半特异性PCR： 半特异性PCR：由一个特异性引物和一个简并 PCR 引物相组合构成的PCR 反应 这种反应会产生3 种不同类型的产物: 这种反应会产生3 种不同类型的产物: (1) 由特异性引物和简并引物扩增出的产物; (2) 由同一特异性引物扩增出的产物; (3) 由同一简并引物扩增出的产物。在TAIL-PCR 反应中,后两种非目标产物可以通过以嵌套的特 异性引物进行的后续反应来消除。
结合型位点的结构 如图。在每个a 如图。在每个a和α 盒中心区域（ 盒中心区域（称Ya 是不同的， 或Yα）是不同的， 而两侧是相同的。 而两侧是相同的。 在中心区域两侧的 序列尽管在HMR中要 短一些， 短一些，但它们是 非常相似的。 非常相似的。在MAT 上的活性盒是从Y 上的活性盒是从Y区 域中的一个启动子 开始转录的。 开始转录的。