依托泊苷脂质体的抗肿瘤活性研究

2019年第14期广东化工
第46卷总第400期·19·依托泊苷脂质体的抗肿瘤活性研究
杨芸，黄颖，梁梦艺，李明娟，计燕萍，黄嬛
(嘉兴学院医学院，浙江嘉兴314001)
Studies on the Anti-tumor Activity of Liposomal Formulations of Etoposide
Yang Yun,Huang Ying,Liang Mengyi,Li Mingjuan,Ji Yanping,Huang Xuan
(College of Medicine,Jiaxing University,Jiaxing314001,China)
Abstract:Objective:To prepare Etoposide-loaded liposomes based on the optimal conditions previously studied in our laboratory and to evaluate their pharmacodynamics.Method:Etoposide liposomes were prepared,the encapsulation efficiency and drug loading were evaluated by HPLC.The free Etoposide and drug-loaded liposomes were applied to small cell lung cancer H446cells and human breast cancer MCF-7cells and the IC50was calculated to compare the inhibitory on the two tumor cells.Results:The entrapment efficiency of the prepared drug-loaded nano-liposomes was79.77%,and the drug loading efficiency was21.65%. Cell pharmacodynamic evaluation experiments showed that the IC50values of the free Etoposide and drug-loaded liposomes against H446cells were2.40μg/mL and1.56μg/mL,respectively;the IC50values of free Etoposide and drug-loaded liposomes against MCF-7cells were1.28μg/mL and0.35μg/mL,respectively. Conclusion:By applying the nanostructured lipid carriers to the model drug Etoposide,the inhibitory of Etoposide on small cell lung cancer H446cells and human breast cancer MCF-7cells was significantly enhanced.
Keywords:Etoposide；liposome；anti-tumor activity
依托泊苷(Etoposide)的化学名是9-(4,6-O-亚乙基-β-D-吡喃葡糖苷)-4’-去甲基表鬼臼毒素，是植物成分鬼臼毒素(Podophyllotoxin)的糖代谢产物[1]。

依托泊苷是鬼臼毒素的半合成
衍生物，属于细胞周期特异性抗肿瘤药物，它对于细胞周期晚S 期或G2期有特异性的作用，有抑制DNA拓朴异构酶II的作用[2-5]，从而表现抗肿瘤作用。

但该药物存在着比较存在严重的骨髓抑制、胃肠道反应，并损伤肝肾，属于典型的剂量限制性药物且在体内分布无选择性，高剂量治疗存在严重毒副作用。

同时由于依托泊苷存在着剂型不稳定、水溶性差等问题，将其用载体包裹可以增加药物在体内的稳定性，改善安全性和稳定性。

已有相关文献报道[6-8]对其进行制备得到微球制剂，可明显改善了药物在体内的配置，减少药物向体内的渗漏。

本论文将通过制备依托泊苷载药脂质体，对其进行细胞药效学考察。

1实验部分
1.1实验试剂与实验仪器
依托泊苷标准品(中国食品药品检定研究院，批号：100388-200401)；单硬脂酸甘油酯(国药集团化学试剂有限公司)；辛酸癸酸三甘油酯(GTCC，英国禾大公司)；泊洛沙姆(沈阳药科大学集绮药业有限公司)；色谱纯乙腈(Fisher Scientific)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；RPMI1640medium(HyClone 公司)；0.25%胰蛋白酶溶液(吉诺生物医药技术有限公司)；青-链霉素溶液(吉诺生物医药技术有限公司)；四甲基偶氮唑盐(MTT，Sigma公司)。

H446和MCF-7细胞(中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库)。

高效液相色谱法(Infinity1260，安捷伦科技有限公司)；超声波细胞粉碎机(JY92-IID，上海比郎仪器有限公司)。

1.2实验方法
1.2.1载药脂质体的制备
依托泊苷溶解于乙腈/水混合溶液中，配成浓度为1mg/mL的溶液，留以备用。

分别精密称取适量单硬脂酸甘油酯和GTCC溶于乙醚，取800μL的0.1%F68水溶液与单硬脂酸甘油酯和GTCC 乙醚溶液置于西林瓶中混合，精密移取200μL依托泊苷乙腈/水溶液加入上述液体，探头超声8min(300W，工作2s，间歇2s)。

置于50℃水浴中加热，挥去乙醚，加入2mL的0.1%F68水溶液后盖上瓶塞继续搅拌3min，探头超声3min(200W，工作2s，间歇2s)，即得依托泊苷脂质体。

取制得的依托泊苷脂质体上清液8000r/min离心10min，使附着于脂质体表面的游离药物颗粒通过离心去除。

1.2.2包封率和载药量的测定
取离心后上清液0.5mL，加入相同体积甲醇0.5mL，45℃左右水浴超声破坏10min。

色谱条件：Eclipse Plus C18色谱柱(4.6×100mm)，柱温为35℃；流动相为乙腈(25%)-醋酸pH=4.0缓冲液(75%)，流速为1 mL/min，检测波长为254nm，进样量为20μL。

用HPLC法测定总药物浓度(C0)。

同时取离心后上清液，将其置于超滤离心管内，12000r/min高速离心10min，滤液用HPLC 法测定游离药物浓度(C)。

按公式(1)，(2)分别计算药物包封率(encapsulation efficiency,EE)和载药量(drug loading capacity,DD)。

包封率(EE,%)=(C0-C)×V/m0×100%(1)载药量(DD,%)=(C0-C)×V/[(C0-C)×V+w]×100%(2) C0为破坏后药物总浓度，单位为μg/mL；C为未包裹的游离药物浓度，单位为μg/mL；V为载药胶束体积，单位为mL；m0为投入药物总量，单位为mg；w为载体质量，单位为mg。

1.3细胞药效学测定
将H446和MCF-7细胞分别常规培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，其中含有青霉素100IU/mL及链霉素100 IU/mL，于体积分数5%CO2、37℃二氧化碳培养箱中培养，维持细胞处于对数生长期。

调整细胞悬液浓度约为30000个/mL，分别接种小细胞肺癌细胞H446和人乳腺癌细胞MCF-7于96孔板，每孔加入0.1mL细胞悬液，置于5%CO2的37℃的孵箱中孵育培养。

加入浓度梯度的药物，6个浓度梯度，每孔0.1mL，设5个复孔。

加药后5%CO2的37℃的孵箱中孵育24~72小时，取出培养瓶置于倒置显微镜下观察。

每孔加入10µL MTT溶液，继续培养4h。

每孔加入100µL二甲基亚砜，在酶联免疫检测仪490nm和630nm两个波长条件下检测各孔溶液的光密度值，其中630nm处的OD值为调零组OD值。

以不同药物浓度为横坐标，以细胞存活率为纵坐标作图绘制细胞生长抑制曲线。

2实验结果
2.1依托泊苷脂质体的包封率和载药量
通过本法制备得到的载药脂质体的平均包封率为79.77%，平均载药量为21.65%(见表1)。

[收稿日期]2019-05-28
[基金项目]浙江省实验动物科技计划项目(2016C37109)
[作者简介]杨芸(1987-)，女，浙江人，讲师，主要研究方向为靶向制剂。

广东化工2019年第14期·20·第46卷总第400期
表1依托泊苷脂质体的包封率和载药量(n=13)
Tab.1The encapsulation efficiency and drug loading of Etoposide
liposome(n=13)
名称包封率(Mean±SEM,%)载药量(Mean±SEM,%)依托泊苷脂质体79.77±1.0421.65±0.88
2.2游离药物和依托泊苷脂质体对小细胞肺癌H446细胞作用
以小细胞肺癌细胞H446为细胞模型，对依托泊苷游离药物和依托泊苷脂质体进行细胞药效学评价(见表2)。

在对H446细胞用药24h后，游离药物和载药脂质体的IC50分别为38.75µg/mL 和10.97µg/mL；48h后的IC50分别为12.32µg/mL和7.73µg/mL；72h后的IC50分别为2.40µg/mL和1.56µg/mL。

在药物作用24h、48h、72h后，对肿瘤细胞的IC50都依次降低，说明依托泊苷随着作用时间的延长对肿瘤细胞的杀伤力依次增大，且在三个时间点载药脂质体对H446细胞的作用均明显强于游离药物。

表2游离药物与载药脂质体对H446细胞的抑制作用
Tab.2The inhibition rates of free Etoposide and liposomal formulations of Etoposide on H446cell proliferation
IC50/(µg/mL)
24h48h72h 游离药物38.7512.32 2.40
载药脂质体10.977.73 1.56
2.3游离药物和依托泊苷脂质体对乳腺癌MCF-7细胞作用
表3游离药物和载药脂质体对MCF-7细胞的抑制作用
Tab.3The inhibition rates of free Etoposide and liposomal
formulations of Etoposide on MCF-7cell proliferation
IC50/(µg/mL)
24h48h72h
游离药物57.6111.34 1.28
载药脂质体 1.31 1.100.35
以小细胞肺癌细胞MCF-7为细胞模型，对依托泊苷游离药物和依托泊苷脂质体进行细胞药效学评价(见表3)。

对MCF-7细胞作用24h后，游离药物和载药脂质体的的IC50分别为57.61µg/mL 和1.31µg/mL；48h后的IC50分别为11.34µg/mL和1.10µg/mL；72h后的IC50分别为1.28µg/mL和0.35µg/mL。

在药物作用24h、48h、72h后，游离药物和载药脂质体对肿瘤细胞的IC50都依次降低，说明依托泊苷随着作用时间的延长对肿瘤细胞的杀伤力依次增大，且在三个时间点载药脂质体对MCF-7细胞的作用均明显强于游离药物。

3结论
本实验制备得到的依托泊苷脂质体，其包封率为79.77%，载药量为21.65%。

包封率和载药量佳，且理化性质较稳定。

对制得的载药脂质体进行细胞药效学评价，结果表明对H446细胞，游离药物和依托泊苷质体的IC50分别为2.40µg/mL和1.56µg/mL；对MCF-7细胞，游离药物和依托泊苷脂质体的IC50分别为1.28µg/mL和0.35µg/mL。

通过应用脂质载体对模型药物依托泊苷进行包裹，对两种肿瘤细胞的抑制作用均显著增强，有待进一步进行深入研究。

参考文献
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[8]姚瑶，陶昱斐，丁燕飞，等．依托泊苷明胶微球的制备[J]．中国现代应用药学，2005，22(03)：219-221．
(本文文献格式：杨芸，黄颖，梁梦艺，等．依托泊苷脂质体的抗肿瘤活性研究[J]．广东化工，2019，46(14)：19-20)
(上接第29页)
为准确评价鸡蛋花面膜液的保湿效果，通过检测使用面膜液60min后皮肤含水量、含油量的变化来评价其保湿性能，以使用后时间为横坐标，皮肤含水量增量、含油量增量为纵坐标，并与某款市售面膜做对比，其结果如图1所示：
实验结果表明：测试者在涂敷本款产品和某款市售面膜液60 min内其皮肤水分含量增量均有不同程度的提高，虽然涂敷市售产品5min后的水分和油分增量相对较高，但40min增量趋于平稳后，本款面膜液的保湿效果相对较好些。

在平稳阶段，使用本款产品的测试者皮肤水分含量维持接近10%的增幅，可见，本款产品具备良好的保湿性。

3讨论
在面膜液基质筛选中，对面膜液的增稠体系、保湿体系、鸡蛋花总黄酮提取液加入量等都进行了探讨，决定选取增稠剂卡波U20、羟乙基纤维素复配，其用量分别为0.10%和0.30%；选取保湿剂甘油、1,3-丁二醇、山梨醇、透明质酸钠复配，用量分别为4.0%、6.0%、3.0%和0.15%；鸡蛋花总黄酮提取液用量为1%，浓度为1g/mL的鸡蛋花流浸膏。

制得鸡蛋花面膜液进行各项理化指标考察，结果表明其各项指标都符合QB/T2872-2007标准，耐寒耐热实验中，均无异常情况出现，其稳定性良好。

功效评价方面，通过对鸡蛋花面膜液进行DPPH自由基清除率、酪氨酸酶活性抑制率实验，结果表明本款产品有一定的抗氧化嫩肤与美白效果。

保湿功效评价中，也表明本款产品保湿效果良好。

这些都为本产品的开发提供了良好的理论基础，进一步的人体试用实验仍需考察。

参考文献
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(本文文献格式：邓金生，邓明玉，彭仲瑶，等．鸡蛋花总黄酮的提取及其面膜液的制备[J]．广东化工，2019，46(14)：28-29)。