诱导成骨分化实验

配制试剂：

●0.5%茜素红S（Alizarin Red S）染液：称取0.5 g茜素红S染料，用蒸馏水

溶解，调节pH为4.2，加蒸馏水定容至100 ml。

●10%甲醛固定液：取10 ml甲醛溶液，用PBS溶液定容至100 ml。

实验过程：

1、复苏MC3T3-E1-GFP细胞（7月21日我冻存的(HLF)）P26，复苏2支

2、长满传代，1传4

3、细胞长满后，消化接种细胞，接种于35 mm的细胞培养皿中，3×105个/皿/2ml。

每个时间点接种4皿，接种6个时间点（0天，2天，4天，6天，7天，8天），共接种24皿（接种后写好时间，细胞代数，切记一定要标记好，标记在皿身上）

4、接种后第3天，将0天组的4皿进行茜素红S染色（染色方法见下），其他皿

更换诱导分化培养基（α-MEM添加10%FBS、50 μg/ml AA与10 mMβ-GP），诱导分化，每隔1天更换新鲜诱导分化培养基，现用现配

5、同样，分别在诱导分化2天，4天，6天，7天，8天时对每组的4皿细胞进

行茜素红S染色。

采用0.5%茜素红S对矿化结节进行染色步骤：

（1）吸去细胞培养基，用PBS清洗细胞2次；

（2）加10%甲醛固定细胞，室温15 min；

（3）PBS清洗细胞1次，加入0.5%茜素红S染液（pH4.2），室温染色15 min；（4）使用自来水对细胞震荡清洗4次，5 min/次；

（5）用显微镜或扫描仪对着色矿化结节进行观察、扫描；

（6）采用Image J分析软件（National Institutes of Health，NIH）对矿化结节面积进行分析。

做完实验后，保留所有染色后的皿。