拟南芥MeIAA抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析(1)

植物学报Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　ｏｆ　Ｂｏｔａｎｙ ２００９，　４４　（１）：　５２−５８，　ｗｗｗ．ｃｈｉｎｂｕｌｌｂｏｔａｎｙ．ｃｏｍ

收稿日期：　２００８－０６－２２；　接受日期：　２００８－０６－２６

基金项目：　国家自然科学基金（Ｎｏ．　３０６２５００２和Ｎｏ．　３０６２８０１２）†共同第一作者。＊　通讯作者。Ｅ－ｍａｉｌ：　ｑｕｌｊ＠ｐｋｕ．ｅｄｕ．ｃｎ

．研究论文．

拟南芥　ＭｅＩＡＡ抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析

侯仙慧１†，　丁茂予１†，　刘赛男１，　李林川１，　瞿礼嘉１，　２＊

１

北京大学生命科学学院，　北京大学－耶鲁大学植物分子遗传和农业生物技术联合研究中心，　蛋白质工程和植物基因工程国家重点实验

室，　北京１００８７１；　２国家植物基因研究中心（北京），　北京１００１０１

摘要 生长素是最重要的植物激素之一，　参与了植物生长发育的各个方面。植物体内游离的ＩＡＡ是生长素的主要活性形式，在ＩＡＡ甲基转移酶１（ＩＡＭＴ１）的作用下，　ＩＡＡ可以转变为ＩＡＡ甲酯　（ＭｅＩＡＡ）。ＭｅＩＡＡ本身没有活性，　在植物体内的ＭｅＩＡＡ酯解酶作用下可以重新转变为ＩＡＡ。　ＭｅＩＡＡ是非极性分子，　能够在植物体内自由扩散。利用ＭｅＩＡＡ的这种特殊性质筛选突变体，　可以分离到ＭｅＩＡＡ代谢途径或者ＩＡＡ途径中新的成分。我们对拟南芥种子进行ＥＭＳ诱变，　通过观察黑暗下下胚轴的生长情况，　筛选ＭｅＩＡＡ的抗性突变体。我们成功分离到了８株可能的抗性突变体，　并对其中的一个Ｍｅｔｈｙｌ－ＩＡＡ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　１　（ｍｉｒ１）　突变体进行了深入分析。ＭｅＩＡＡ抗性突变体的筛选将为进一步了解ＭｅＩＡＡ的代谢、ＩＡＡ稳态调控和响应机理提供新的材料。

关键词 生长素，　图位克隆，　ＭｅＩＡＡ，　抗性突变体

侯仙慧，　丁茂予，　刘赛男，　李林川，　瞿礼嘉　（２００９）．　拟南芥　ＭｅＩＡＡ抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析．　植物学报　４４，　５２−５８．

生长素（ａｕｘｉｎ）是由荷兰科学家Ｆ．　Ｗ．　Ｗｅｎｔ通过燕麦胚芽鞘弯曲实验法　（Ａｖｅｎａ　ｃｕｒｖａｔｕｒｅ　ｔｅｓｔ）　首次分离出来的（Ｗｅｎｔ，　１９２６）。随后人们提取并鉴定得到了第１种生长素——吲哚－３－乙酸（ＩＡＡ）。大量的实验表明ＩＡＡ在高等植物中广泛存在，　是植物体内主要的生长素（Ｔｅａｌｅ　ｅｔ　ａｌ．，　２００６）。ＩＡＡ调控植物体内生长发育的许多过程，　如促进侧根形成、维管组织分化、胚胎发育、顶端优势及植物向性反应等（Ｗｏｏｄｗａｒｄ　ａｎｄ　Ｂａｒｔｅｌ，２００５ａ）。　生长素在体内主要通过色氨酸依赖途径进行生物合成，　可以与糖、氨基酸、肽以及醇形成缀合物进行贮存或运输，　也可以通过氧化失去激素活性　（Ｌｊｕｎｇ　ｅｔａｌ．，　２００１）。　生长素是一种极性分子，　是目前发现的唯一需要极性运输的激素，　ＰＩＮ蛋白家族是主要的生长素输出载体，　而ＡＵＸ１蛋白是生长素输入载体，　ＰＩＮ和ＡＵＸ１蛋白在细胞膜上具有不对称分布，　受到囊泡运输的调控（Ｌｅｙｓｅｒ，　２００３；　Ｈｏｂｂｉｅ，　２００６）。　生长素信号转导主要是由ＳＣＦＴＩＲ１介导的蛋白泛素降解途径，　高浓度的ＩＡＡ促进其受体ＴＩＲ１和转录抑制因子ＡＵＸ／ＩＡＡ家族蛋白的

结合而使ＡＵＸ／ＩＡＡ家族蛋白泛素化降解，　从而解除了对转录因子ＡＲＦ家族蛋白的转录抑制，　进而激活或者抑制下游基因的表达　（Ｗｏｏｄｗａｒｄ　ａｎｄ　Ｂａｒｔｅｌ，　２００５ｂ；　Ｔａｎｅｔ　ａｌ．，　２００７）。

本实验室发现拟南芥ＩＡＡ　ｃａｒｂｏｘｙｌ　ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎ－ｓｆｅｒａｓｅ１（ＩＡＭＴ１）基因的一个功能获得性突变体ｉａｍｔ１－Ｄ具有叶片上卷表型　（Ｑｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　２００５）。　当通过ＲＮＡｉ降低ＩＡＭＴ１的表达时，　转基因植株叶片下卷。而且，ＩＡＭＴ１的表达在叶片发育过程中受到严格的时空调控。叶片卷曲程度和ＩＡＭＴ１表达水平相关表明，　生长素的稳态调控对于扁平叶片的形成起重要作用　（Ｑｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，２００５）。　在体外，　ＩＡＭＴ１蛋白能够把ＩＡＡ转化为ＩＡＡ甲酯　（ＭｅＩＡＡ）。Ｌｉ等通过研究ａｕｘｉｎ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　１　（ａｕｘ１）突变体对ＭｅＩＡＡ、ＩＡＡ和ＮＡＡ的不同响应，　发现ＭｅＩＡＡ与其它ＩＡＡ缀合物一样，　也是没有活性的。但是由于ＭｅＩＡＡ是非极性的，　所以其进入细胞同ＮＡＡ一样不需要载体协助　（Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００８ａ）。ＭｅＩＡＡ的运动性暗示它与ＩＡＡ糖、氨基酸缀合物不同，　不是作为贮存或者降

５３侯仙慧等：　拟南芥　ＭｅＩＡＡ抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析

解的形式，　而是通过微调ＩＡＡ的分布，　从而影响植物发育过程，　如叶片的形态等　（Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００８ａ）。Ｙａｎｇ等研究表明ＭｅＩＡＡ进入细胞后，　通过细胞内的一个或几个可能的酯解酶酯解后重新转变为ＩＡＡ起作用（Ｙａｎｇ　ｅｔａｌ．，　２００８）。他们鉴定了拟南芥ＡｔＭＥＳ１７基因，　其编码一个ＭｅＩＡＡ酯解酶，　在体外该蛋白能够将ＭｅＩＡＡ转变为ＩＡＡ。ＡｔＭＥＳ１７的缺失突变体表现出对ＭｅＩＡＡ的显著抗性，　而过量表达ＡｔＭＥＳ１７的转基因植株则对ＭｅＩＡＡ具有更强的敏感性，　同时这两种株系对ＩＡＡ的响应正常　（Ｙａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　２００８）。

利用激素突变体来研究激素代谢及其分子机制已有不少成功的范例，　突变体分析不仅可以对某一复杂生物学过程提出合理的假设，　而且可更进一步精确找出研究生理和发育问题的新方法。由于在黑暗下ＭｅＩＡＡ比ＩＡＡ具有更强的下胚轴抑制能力，　利用ＭｅＩＡＡ筛选生长素抗性突变体将更加简单易行。本实验通过筛选经ＥＭＳ诱变产生的拟南芥突变体种子，　外源施加一定浓度的ＭｅＩＡＡ，　在黑暗下观察下胚轴生长，　筛选对ＭｅＩＡＡ具有抗性的突变体，　并做进一步的遗传和基因定位分析，　为深入了解ＩＡＡ的甲基化过程在ＩＡＡ信号转导和稳态调控中的作用提供新的方法。

１ 材料与方法

１．１ 植物材料和培养条件

本研究中所用的拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）除用于图位克隆的为Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ　（Ｌｅｒ）　野生型外，　其余的都为Ｃｏ－ｌｕｍｂｉａ　（Ｃｏｌ－０）　背景。处理方法和培养条件见Ｌｉ等论文　（Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００８ｂ）。

１．２ ＥＭＳ诱变

将２．５　ｇ拟南芥种子均分在２个５０　ｍＬ的Ｆａｌｃｏｎ试管中，　加入４０　ｍＬ去离子水室温过夜。向每个试管中加入１２０　µＬ　ＥＭＳ　（Ｓｉｇｍａ），　使ＥＭＳ终浓度为０．３％。在通风橱内翻转摇匀１５个小时。再用４０　ｍＬ去离子水漂洗种子６次以上，　最后将种子用０．１％　琼脂均匀悬浮，　铺在约２０个培养箱中。单箱收获得到Ｍ２代种子，　编号，室温保存。

１．３ ＭｅＩＡＡ抗性突变体的筛选

将表面消毒后的种子点播在含有２．５　µｍｏｌ

．Ｌ－１　ＭｅＩＡＡ（Ｓｉｇｍａ）的ＭＳ培养基上，　用锡箔纸包裹避光。４°C春化２天，　然后放入２２°C培养箱中培养４天，　挑取下胚轴长度远远超过平均值的小苗（图１），　转移到ＭＳ培养基上，恢复培养５天，　再转移到土中。一个月后单收种子，　在ＭｅＩＡＡ培养基上鉴定该抗性是否可以遗传。

１．４ 突变体温度转移实验

将种子表面消毒后，　铺在ＭＳ培养基上，　４°C春化２天，然后转到２２°C，　水平萌发３天。转移大约２０棵小苗到新的ＭＳ平板上，　共转移２块。将其中一块仍然放在２２°C条件下，　另一块转至２９°C，　垂直培养３天。比较２个生长条件下的植株下胚轴长度，　并统计。

１．５ 图位克隆

图位克隆（ｍａｐ－ｂａｓｅｄ　ｃｌｏｎｉｎｇ）参考Ｌｕｋｏｗｉｔｚ　等（２０００）描述的方法。实验中所用Ｍａｒｋｅｒ均来自拟南芥网站（ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ）。

２ 结果与分析

２．１ＭｅＩＡＡ抗性突变体筛选条件的确定

在进行大规模突变体筛选之前，　我们首先比较了ＩＡＡ和ＭｅＩＡＡ对黑暗下生长的拟南芥幼苗的下胚轴抑制程度。在０．１－２５　µｍｏｌ

．Ｌ－１浓度范围内，　随着激素浓度的升高，ＩＡＡ和ＭｅＩＡＡ对下胚轴的抑制程度都增强，　但是ＭｅＩＡＡ的抑制能力更强，　两者在２．５－１０　µｍｏｌ

．Ｌ－１范围内差异最为显著（图１Ａ）。在２．５　µｍｏｌ

．Ｌ－１　ＭｅＩＡＡ浓度下，　拟南芥幼苗下胚轴长约为ＭＳ培养基上的１０％。在大于２．５　µｍｏｌ

．Ｌ－１的浓度下，　ＭｅＩＡＡ对下胚轴的抑制程度随浓度变化很小（图１Ａ）。综合上述两种现象，　我们选取２．５　µｍｏｌ

．Ｌ－１的ＭｅＩＡＡ处理经ＥＭＳ诱变的Ｍ１代种子进行筛选。

野生型幼苗在２．５　µｍｏｌ

．Ｌ－１　ＭｅＩＡＡ培养基上暗培