基因敲除方法专题-郭

被抑制。开始这被认为是矮牵牛特有的怪现象。
然而，并非只有植物学家才注意到了这种意外的现象。 意大利的Cogoni等,将外源类胡萝卜素基因导入链孢
霉(Neurosporacrassa),结果转化细胞中内源性的类
胡萝卜素基因也受到了抑制。而在真菌转基因实验中
这种共抑制现象被称为“quelling”现象。
5.完美基因靶向操作： 识别特异DNA序列结构+操作DNA的酶
划时代的基因靶向操作技术： TALE与 CRISPR/Cas9使靶向操作不再是梦 我们不再大海捞针！！！
RNA干扰技术
RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高 度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱 发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。是真核生物中存在 的一种抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控 机制，具有重大生物学意义。 RNAi技术被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之 一，并名列2002年十大科学进展之首。由于使用RNAi技术可 以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛 用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域 。 2006年，安德鲁·法厄与克雷格·梅洛（Craig C. Mello） 由于在RNAi机制研究中的贡献获得诺贝尔生理及医学奖。
图位克隆策略
寻找性状差异 选择父母本 杂交-F1
或突变体
差异显著（最好其他性状差异较小） 不分离 性状分离 单粒传
自交
构建群体 表型统计
分子标记 软件分析初步定位
回交-扩大群体
SSR等
近等基因系
精细定位
基因组文库
1-5cM甚至更小
探针筛选
叠连克隆群 染色体步移
目标基因连锁的分子标记
外显子的分离、鉴定
确定基因 功能互补实验
转基因过表达、基因敲除
基因敲除专题
基因敲除概述 基因敲除(knockout)是一种遗传工程基因修 饰技术，针对某个感兴趣的遗传基因，通过一定 的基因改造过程，令特定的基因功能丧失，并研 究可能进一步对相关生命现象造成的影响，进而 推测该基因的生物学功能。 基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基 因的同源重组。指外源DNA与受体细胞基因组中 序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替 受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整 合入受体细胞的基因组中，达到定点修饰或改造 染色体上某一基因的目的。
解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱
导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，
RISC)。在ATP酶的作用下，活化的RISC以单链
siRNA为向导识别同源性的单链靶mRNA，并在距离 RISC的3’端11个碱基位臵切割靶mRNA，导致靶基 因的沉默。
RISC由siRNA、解 旋酶、ATP、核酸内 切酶、核酸外切酶等 多种成分组成。
基因敲除的方法
同源重组敲除技术 条件性基因敲除法 诱导性基因敲除法 锌指核酸酶(ZFNs)技术 RNA干扰技术 TALEN技术 CRISPR-Cas9技术
生物学家的梦想：随心所欲地操作基因
经典基因操作： 1. Gene trap: 化学诱变； 转座子--------海量的筛选+good Luck 2. 同源重组：一般物种几率低, 10-6 ； ES cell 10-2 难！ 3.突破性的发现： RNAi-Knockdown; 不完全敲除，临时性。 4.充满梦想却幻灭的ZFN： • 难以完全找到匹配的3连子锌指； • Off-target 严重。 美国加州大学Dave Segal教授说： “ With zinc fingers, we have to let the DNA tell us where we target”
四、RNAi研究的一般技术路线
目的基因mRNA序列分析 设计siRNA序列 正义RNA和反义RNA的合成 构建转基因载体 转入受体细胞 检测基因抑制结果
存在的问题

目前siRNA导入胞内的效率低下，如何有效将siRNA转移 入体内成为RNAi应用的最大障碍； 如何在目的基因序列上选择21-23nt左右的序列作为 siRNA 的模板，从目前的研究来看，序列的选择原则尚不 清楚； 目前RNAi 机制尚未完全阐明，尤其在哺乳动物细胞中的 研究报道不多。 siRNA的稳定性 在多基因家族中的非特异性问题 如何将RNAi技术运用到临床试验
一、RNAi的发现简史
90年代初，Rich Jorgensen和其同事,在对矮牵牛(petunias)进行
研究中有个奇怪的发现:将一个能产生红色素的基因臵于一个强启
子后,导入矮脚牵牛中,试图加深花朵的紫颜 色,结果没看到期待中的深紫色花朵,多 数花成了花斑的甚至白的。Jorgensen 将这种现象命名为 共抑制现象(cosuppression), 因为导入的基因和其相似的内源基因同时都
反义RNA技术的原理
• 利用基因重组构建人工表达载体,使其体 外或体内表达反义RNA,通过碱基互补与靶 RNA配对结合,封闭或抑制靶基因的表达, 从而对细胞的功能产生影响
二、RNAi现象的普遍性
随后陆续发现RNAi也存在于水稻、烟草、果蝇、小鼠
及人等几乎所有的真核生物中。
RNAi能高效特异的阻断基因的表达，在线虫，果蝇体内，
沉默；对于部分植物来说，转基因引发的基因沉默可能是因为基 因特异的甲基化而导致;
PTGS 则是指转基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细
胞质里却无相应的mRNA存在这一现象。目前普遍认为RNAi、共
抑制、quelling均属于PTGS！
dsRNA介导的同源性靶mRNA降解 过程
第一步（起始阶段）是较长ds RNA在ATP参与下 被RNaseⅢ特异核酸酶切割加工成21~23nt的由正义和
TALE的发现迅速成为科技最前沿
TALEN技术形成的关键研究
Sugisaki Hiroyቤተ መጻሕፍቲ ባይዱki 发现FokI核酸酶 （1981）
Jens Boch 破译TALE序列 （2009）
Daniel F. Voytas Adam J.Bogdanove 将TALE DNA结合motif与FokI核酸酶融 合，推出与ZFN同类型的双链DNA剪刀， 称之为TALEN。(2011)
差异蛋白点过多，测序片段随机且过短，氨基酸→碱基序列简并 性过高
高通量基因芯片（诺丁汉大学—陆春贵博士）：
差异性状---基于已知序列---高通量表达差异分析---确定大量关 联基因---新基因---价格昂贵---数据分析处理复杂
图位克隆
群体至关重要---工作量超大---获得基因随机---仍是王道
What’s more...
• 1995年康乃尔大学的研究人员Guo
和Kemphues尝试用反义RNA
(antisense RNA)去阻断秀丽新小 杆线虫(Caenorhabditis.elegans)
的par-1基因的表达以探讨该基因
的功能,结果反义RNA的确能够阻断 基因的表达,但是奇怪的是,注入正 义链RNA(sense RNA)作为对照,也 同样阻断了基因的表达。这与传统
上对反义RNA技术的解释正好相反
反义RNA技术
• 反义RNA是指与mRNA互补的RNA分子，也包括与其它RNA互
补的RNA分子。
• 由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异
性的互补结合, 即抑制了该mRNA的翻译。通过反义RNA控制
mRNA的翻译是原核生物基因表达调控的一种方 式，最早是在 E.coli 的产肠杆菌素的Col E1质粒中发现的，许多实验证明在真 核生物中也存在反义RNA。
• 这个奇怪的现象直到3年后1998才被解开———华盛顿卡耐基研 究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello首 次将双链dsRNA———正义链和反义链的混合物注入线虫,结果 诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默。 将制备的RNA高度纯化后发现，正义RNA无基因抑制作用，反义 RNA的基因抑制作用也很微弱，而用纯化后的dsRNA注入线虫， 却能高效、特异地阻断相应基因的表达 。实际上每个细胞只要 很少几个分子的双链ＲＮＡ已经足够完全阻断同源基因的表达 。 • 后来的实验表明在线虫中注入双链ＲＮＡ不单可以阻断整个线 虫的同源基因表达,还会导致其第一代子代的同源基因沉默。他 们将这种现象称为dsRNA介导的RNA干扰（RNAi）。 • 并证明了Guo和kemphues所发现的正义RNA的基因压制作用其实 是转录时污染微量dsRNA所造成的。
Dicer
第一步
RISC
碱基互补
酶解
第二步
RNAi的放大效应机制
• siRNA不仅可引导RISC切割靶mRNA，而且可以以siRNA 作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶 mRNA为模板合成新的dsRNA ，它在Dicer酶的作用下也 被裂解，生成大量的次级siRNA。形成一种链式反应 ，使特定的基因表达被阻止。
反义RNA技术
• 根据反义RNA的作用机制可将其分为3类： • Ⅰ类反义RNA直接作用于靶mRNA的S D序列(ShineDalgarno sequence）和(或)部分编码区，直接抑制 翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，从而易被RNA酶 Ⅲ 降解 • Ⅱ类反义RNA与mRNA的非编码区结合，引起mRNA构象 变化，抑制翻译； • Ⅲ类反义RNA则直接抑制靶mRNA的转录。
体内蛋白水平 验证
如何获取基因
同源克隆：
已知基因序列比对---保守区---简并引物设计---未知物种中分离 ---RACE获得全长---结构解析---表达分析---功能比较与验证等
优点：简单，短平快 局限：过于简单，技术含量低，非新基因，文章水平相对较低 后续试验内容需增加
蛋白差异分析： 性状差异---双向电泳---蛋白点分离---氨基酸组成分析---序列 端部分析---DNA信息
RNAi能达到基因敲除的效果。
三、RNAi的作用机制
基因沉默
基因沉默分为转录水平的基因沉默(Transcriptional Gene
Silencing, TGS) 和转录后水平的基因沉默(Post-transcriptional
Gene Silencing, PTGS)两种：

TGS是指转基因在细胞核内RNA 合成受到了阻止而导致基因


TALEN技术
TALE (Transcription Activator-Like Effector) 是由植物致 病细菌Xanthomonas分泌的一类具有转录激活功能的蛋白，该种 蛋白通过其内部保守的重复氨基酸序列（即DNA结合域）与植物 宿主基因启动子区的相应核苷酸序列发生特异性结合，并激活 基因表达。
反义链组成的小干扰RNA（small interfering RNA，
siRNA）。
r
RNAi过程的功能单元：siRNA
• siRNA的两条单链末端为5’－磷酸和3’－羟基，且3’端
均有２~3个突出的核苷酸。果蝇中的RNaseⅢ核酸酶
称为Dicer。
19 nt duplex
第二步（效应阶段）是siRNA 在ATP参与下被RNA
• 2011年《Nature》杂志将TALEN技术列为 年度技术，2012年的《Science》杂志则将 其列入了年度十大科技突破，针对该文的 评论更是给予它基因组的巡航导弹技术的 美誉。
生命科学研究进展 基因功能研究之基因敲除技术
生物科学技术学院 郭志富 2014年11月21日
前
什么是基因？
言
为什么要研究基因？
如何研究？
原核体外表达
蛋白质功能 体外鉴定 转基因 进一步验证 表达规律-qPCR Western blotting
真核过表达 位置—分类--结构—功能 基因敲除
定量表达
TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease) 是一种人工改造的限制性内切酶，是将TALE的DNA结合域与限制 性内切酶 (FokⅠ) 的DNA切割域融合而得到。由于TALE的DNA结 合域中的重复氨基酸序列模块可以与单碱基发生特异性结合， 因此理论上可以任意选择靶DNA序列进行改造，是一种非常有效 的基因组改造工具酶。