组织培养技术(7) 共41页

1、多凹塑料板培养
［程序］ (1)消化 (2)低密度细胞悬液的制备 (3)接种 (4)标记 (5)分离扩大培养
注意：①观察并挑选孔内确实仅含有 一个细胞后，才可进行标记； ②标记时要挑选含有健康细胞孔 (细胞体积适宜，轮廓清晰完整)
2、其他方法 ［平皿分离法］ ［射线照射分离法］
射 线 照 射 分 离 法
第九章 组织培养细胞 生物学性状检测
第一节 一、 长有细胞的盖玻片是最适宜的
观察对象。
一般染色法： 1、Giemsa染色法 2、苏木精-伊红(HE)染色法 3、Feulgen染色法 4、
20世纪90年代以来，随着细胞生物学、 分子生物学、免疫学以及遗传学等基础学 科的迅猛发展，以及干细胞和组织工程技 术在现代医学基础和临床的应用，使得现 代再生医学在血液病、肌萎缩、脑萎缩等 神经性疾病的治疗方面显示出良好的发展 前景。
组织工程学被认为是继细胞生物学和分子 生物学之后，生命科学发展史上又一新的 里程碑。组织工程学的出现，意味着外科 学已经进入了“再生医学”的新阶段。
立体培养：利用人工支架，构建成类似细胞在体 内的环境，从而能促细胞不仅增殖和分化，可能 呈现出类体内组织结构和功能性状。
现代三维培养系根据细胞种类和性状，能 应用各种不同性质的支持物进行细胞培养；使细 胞深入支架中，与支架一起形成细胞／支架复合 物(Cells／Scaffold Complex，CSC)。
组织培养技术
Tissue Culture Technique （七）
第二节 特殊培养法 一、二倍体细胞培养法
(Diploid Cell Culture) 以下措施可能利于二倍体细胞培养: 1、严格控制pH值 2、换液时间不要间隔太长 3、传代期不能过长 4、要选用高质量的培养基和血清 5、传代后如细胞不用于实验，
诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS cells）是利用病毒载体 将四个转录因子（Oct4、Sox2、 Klf4 、 c-Myc）的组合转入分化的体细胞中，使 其重编程为类似胚胎干细胞的一种细胞类 型。iPS细胞同样具有自我更新和分化的全 能性。
iPS技术具有巨大的潜在应用价值，利用 iPS技术能够获得病人或者疾病特异的多能 性干细胞，这样可以避免移植过程中的免 疫排斥问题，也绕开了人类胚胎干细胞研 究所带来的伦理问题。
因培养要求不同、三维支架结构各异，反应器 多种多样。
世界上第一位提出“人类组织工程学” 术语的是美籍华裔科学家冯元桢教授。
组织工程学的基本原理：从机体获取少 量活组织的功能细胞，与可降解或吸收 的三维支架材料按一定比例混合，植入 人体内病损部位，最后形成所需要的组 织或器官，以达到创伤修复和功能重建 的目的。
立即低温冻存。
(二)方法 二倍体细胞培养方法关键在于传代。
传代注意事项： 条件培养：新旧培养液按2：1 混合； 按一分为二比例接种培养。
讨论：如何保留大量可利用的二倍体细胞? 在初代二倍体细胞培养时，要接种多量
细胞，生长成功后立即冻存作为种子细胞 (Stock)。
二、单细胞克隆（分离）培养
要求 原理 稀释细胞克隆法
三维培养为细胞提供与体内近似的微环境， 能促进细胞在体内增殖和发生分化，最终能成为 组织替代物。其要点为细胞和人工支架。
三维培养需要从二维的单层细胞培养开始 首先要选择好培养的干细胞
把握增殖和分化也是一个难题 没有增殖不能保证细胞数量 没有分化不能获得细胞质量
支架材料在三D培养中起细胞外基质的作用 支架材料最基本条件： ①无毒性及与组织有相容性（不引起炎症反应） ②可控生物降解性：终被吸收或排出体外； ③多孔性：具有丰富的泡沫状孔隙，供细胞栖
在种子细胞方面，研究自体细胞简易培 养、扩增技术，使其能在短时间内获得 数量足够和功能很强的种子细胞，并能 降低成本将会在临床有更大的应用价值。
在细胞培养技术方面，快速扩增细胞的 形态、功能检测；生长因子的临床应用 和安全性问题；细胞生长与应力的关系 等均需进行深入研究。此外，寻找理想 的支架材料，探讨细胞与支架材料的相 互作用，进行动物体内植入实验与临床 验证研究和检测及评价、组织工程产品 的产业化等都有待深入。
诱导多能干细胞研究进展
2009年8月13日，国际权威杂志《人类分 子遗传学杂志（Human Molecular Genetics）》在线发表了中科院上海生命科学 院/上海交大医学院健康科学研究所研究员金颖 教授带领的干细胞研究组与附属新华医院陈方 教授合作的诱导多能干细胞研究最新进展。该 项研究第一次在孕妇产前诊断的羊水细胞中高 效快速建立了诱导多能干细胞，重编程所需要 的时间（6天）为人类诱导多能干细胞相关报道 中最短者，减少了在这个过程中细胞发生变异 的可能，也为重编程的机制研究以及基于新型 技术探讨重编程的研究提供了理想的细胞来源。
第八章 组织类型培养和 三维（3D）培养技术
组织类型培养(Histotypic Culture)是 一种力求使培养的组织与体内组织状态 近似的培养方法。组织类型培养与三维 立体培养并无本质上的差别，只为叙述 上方便的分类而已。
不同培养方法Hale Waihona Puke Baidu件和要求
培养方法包括：
海绵培养、中空纤维培养、微载体培养、微球培 养、滤过槽培养和切片培养等。
提高克隆形成率的措施： 1）培养基：选用适应性或条件培养基 2）血清：胎牛血清 3）饲细胞 4）激素：胰岛素、地塞米松 5）CO2：5%（特殊：2%、10%） 6）底物特殊处理：多聚赖氨酸 7）适应性底物
三、加支持物培养法
玻片、特氟隆薄膜、鸡卵壳膜、 胶原、硅橡胶等 （一）膜片支持物培养法 （二）微载体细胞培养法
息、生长和增殖；并允许血管长入、液体和 气体的通透，以便于细胞代谢和物质交换； ④加工可塑性：随患者缺陷发生部位和组织结 构的不同，支架应能任意塑造成各种形状和 大小、以便于加工制作成适应临床需要的移 植物。
在三维培养中，基础是单层培养方法收获细胞。
把细胞接种入三维支架中后，则必须置入生物 反应器(Biomacto)或简称反应器中。