骨髓干细胞向肝样细胞分化的研究进展

综述·讲座骨髓干细胞向肝样细胞分化的研究进展*

蔡磊，潘明新

南方医科大学珠江医院肝胆二科（广州510282）

骨髓干细胞（bone marrow stem cells，BMSCs）是一类具有自我复制功能和分化潜能的早期未分化细胞，属于成体干细胞中的一种，主要包括造血干细胞（hemopoietic stem cells，HSCs）和间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）。近年来，人们对BMSCs的多向分化潜能性有了越来越全面的认识。BMSCs可以跨越胚层横向分化为各种组织细胞（包括肝样细胞），并且具备取材方便、体外培养技术成熟以及自体移植潜能等优点，因此其有望成为生物人工肝支持系统或肝细胞移植的理想种子细胞。

1BMSCs向肝样细胞分化的体内体外研究

骨髓中存在着与肝脏相同标志（包括c－kit、CD34、Thy－1+等）的干细胞，在一定条件下可诱导分化为肝前体细胞和成熟肝样细胞。其诱导方法包括加细胞因子干预、与肝细胞或肝非实质细胞共培养以及转基因。目前，BMSCs向肝样细胞分化的研究主要分为体内和体外研究两个方面。1．1体内研究BMSCs在肝损伤、肝功能衰竭环境下能够在肝内分化成具备部分甚至全部肝细胞功能的肝样细胞，在一定程度上改善肝功能。LI等［1］将用粒细胞集落刺激因子处理过的CD34+HSCs植入放射诱导急性肝损伤的小鼠体内，发现肝组织修复能力明显增加。KAO等［2］用免疫选择法从成人骨髓中分离出MSCs，然后通过反转录聚合酶链反应证实MSCs具有向表达肝特异性表面标记基因的肝样细胞分化的潜力，进一步用细菌内毒素脂多糖诱发重症联合免疫缺陷小鼠肝损伤，再将用纤连蛋白处理过的MSCs源性肝样细胞移植到其体内，通过对照发现，纤连蛋白可以增强MSCs源性肝样细胞的细胞保护能力，促进肝损伤修复。近几年，考虑到BMSCs移植的疗效差异性和局限性，越来越多的学者将注意力集中在对移植干细胞的基因修饰上，其中高表达肝细胞生长因子（HGF）基因、尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活质基因和IL－10基因修饰BMSCs移植已经被报道能明显减轻肝纤维化，改善肝功能［3－5］。将细胞治疗和基因结合起来治疗疾病的研究方向也为临床医生开辟了一条新思路。此外，随着组织工程和再生医学的发展，近几年微包囊技术也越来越多地被应用于BMSCs的肝病治疗上。微包囊技术可以固定植入体内的干细胞，使其处于一个较为有利的微环境，从而提高植入干细胞的存活率和代谢功能。SHI等［6］在体外用海藻酸钠－多聚赖氨酸－海藻酸钠（APA）微胶囊将分离培养的肝细胞和MSCs包裹，然后将其植入急性肝功能衰竭大鼠模型体内，通过对照观察发现大鼠的肝功能显著改善，存活率明显提高。

1．2体外研究如何高效地获得大量功能性肝样细胞一直是BMSCs体外研究的方向。由于一些细胞因子，如HGF、表皮生长因子（EGF）等，在肝脏的发育和再生过程中起重要的作用，因而单独和联合应用这些细胞因子或生长因子在体外诱导干细胞增殖并向肝样细胞分化成为了目前研究的一大热点。此外，肝功能衰竭患者及动物的血清、胆瘀血清等多类血清和一些化学物质如地塞米松、尼克酰胺等也是常见的诱导因子。细胞因子的种类、浓度、作用时间和作用时段等都会影响BMSCs的分化、增殖甚至分化后细胞的生物学特性。舒赛男等［7］通过实验比较了HSCs和MSCs的肝样分化潜能，发现两者具有不同的肝系分化潜能。MSCs在HGF/ FGF－4的作用下表达成熟肝细胞的特异性基因，分化为成熟肝细胞样细胞；HSCs在HGF/FGF－1/FGF－2的作用下表达早期肝特异性基因，分化为肝干细胞样细胞。CHIVU 等［8］验证了联合使用较单用某些细胞因子更能提高MSCs 定向分化为肝样细胞的转化效率。YANG等［9］发现射频肝损伤兔的血清可促进自体MSCs增殖并向肝样细胞诱导分化，且效率明显高于EFG培养体系。表明在肿瘤射频消融治疗的同时行肝样细胞移植修复肝损伤具有一定的可行性。

有关BMSCs共培养体系的研究也较多。DENG等［10］将MSCs与肝星状细胞在体外共同培养，通过对照发现只有激活的肝星状细胞对MSCs的分化有调控作用，强调了MSCs 肝样分化微环境中肝星状细胞的效应。而在此共培养过程中，又有研究发现MSCs能显著抑制肝星状细胞的增殖，其机制可能是通过下调Cyclin D1表达、上调p27蛋白表达，使细胞周期停滞于G

/G

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期实现的［11］。

虽然BMSCs的单层和二维培养诱导体系已经广泛建立，但是其肝样分化效率低下。由于三维支架更能模拟干细胞在体内生长的微环境，有望成为肝脏组织工程中理想的生物材料［12］。LI等［13］用外涂胶原的乳酸－羟基乙酸共聚物三维生物支架培养由MSCs分化来的肝样细胞，发现特异性细胞表面标志的表达比单层培养体系早1周，且分化的肝样细胞在三维支架中代谢功能更强，生长更稳定。KAZEMNE-JAD等［14］用工程纳米纤维支架培养MSCs，发现支架上培养出的细胞产生白蛋白、尿素和转铁蛋白的效率明显高于二维培养体系，进一步证实了支架更有利于提高MSCs向功能性肝样细胞的分化效率。

2BMSCs向肝样细胞分化的机制研究

BMSCs向肝样细胞分化的事实多数实验已经证实，但其具体的分化机制尚存争议。目前，主要观点有：（1）横向分化学说：MSCs本身具有多向分化潜能，可以分化为肝样细胞；（2）细胞融合学说：MSCs首先与宿主肝细胞融合，然后进一步分化为肝样细胞；（3）吞噬细胞学说：骨髓来源的单核细胞，如巨噬细胞或其前体细胞，进入肝脏后，可吞噬肝细胞，然后在肝特定的微环境中被诱导分化为肝样细胞；（4）胚胎干细胞（ESCs）样细胞学说：骨髓组织中残留有ESCs样

*广东省自然科学基金资助项目（编号：8151051501000067）

细胞，可在肝组织的微环境中被诱导分化为肝样细胞；（5）诱导原位细胞生长：有部分研究认为，通过静脉移植到体内的MSCs能够迁移到受损伤的心脏和肝等组织中，并且能够促进受损组织的修复，但结果并不是因为它们向这些类型的成熟细胞分化，而是分泌细胞因子，促进了原有组织细胞的生长。

BMSCs分化成肝样细胞是一个非常复杂的过程，研究证明干细胞所处的微环境是其定向分化的决定因素。细胞局部的微环境包括细胞周围多种细胞因子、激素、基质细胞和细胞外基质等。细胞因子的作用尤为重要，在不同的细胞因子作用下MSCs可分化为不同的细胞类型。研究表明，微环境中的各种因子的表现类型、浓度和应用次序是影响MSCs 分化的重要因素。从目前的研究结果可以得到一些初步认识：在体外，研究者通过模拟体内肝细胞分化和成熟所需的微环境，加入各种细胞因子和诱导药物，来诱导BMSCs转化为肝细胞。在体内，受损肝脏内先产生基质源性细胞因子1α和干细胞因子，然后召集BMSCs到达肝内损伤部位，接着肝脏未受损的实质和非实质细胞产生较多的可溶性纤连蛋白，使BMSCs更易植入，在微环境因素诱导下，通过一定的信号通路传递，有选择地激活或抑制相关转录因子，启动相关基因，通过特定的转录和翻译水平调控，胞内相关蛋白合成增加或减少，生物学效应进一步增强或减弱，从而使细胞在生化、结构和功能上发生变化。侯外林［15］采用蛋白质组学相关技术检测了急性药物性肝功能衰竭模型组与健康对照组的肝组织内微环境的蛋白质表达差异，并通过蛋白组学相关软件及生物信息学等方法从中筛选出了27个差异蛋白，发现其中与干细胞生长发育有关的酪蛋白激酶Ⅰ亚型阿尔法（CKⅠα）、T盒转录因子明显上调，而酪氨酸蛋白激酶下调，提示三者很可能与干细胞分化密切相关。有研究［16］发现CKⅠα可能通过Wnt或Hh信号通路诱导BMSCs向肝样细胞分化，目前，国内外研究也表明多种信号通路参与了BMSCs向肝样细胞分化的调控，并发挥着重要作用。柯尊富［17］在细胞信号转导与BMSCs的肝样分化的研究中得出初步认识：MSCs肝样分化过程中，Notch信号通路明显被下调，提示Notch信号通路的下调可能有助于BMSCs的肝向分化，而TGF－β信号通路和Jak－stat信号通路各基因的表达趋势不规则，说明它们也许对维持BMSCs的高增殖性有重要作用。Wnt信号的下调可以促进MSCs向肝细胞分化；而Wnt信号的上调可以抑制MSCs向肝细胞分化，使MSCs保持未分化状。目前，虽然微环境中各种因子的作用尚未完全确定，但是必要的因子在准确的时间和阶段起作用是BMSCs 分化为肝样细胞的关键。因此，对微环境中蛋白分子及其相关信号通路的研究有助于初步阐明BMSCs体内定向分化为肝样细胞的分子机制。

3BMSCs肝样分化在临床上的应用

BMSCs可以定向分化为肝前体细胞和成熟肝样细胞，参与肝脏的损伤修复、细胞更新、功能重建等病理生理过程，显示了BMSCs在肝病治疗中的巨大应用潜能。自20世纪70年代Sutherland用肝细胞移植治疗急、慢性肝功能衰竭的动物实验获得成功以来，利用干细胞来治疗肝脏疾病的新思路越来越受到重视。KHARAZIHA等［18］对8例终末期肝病患者移植自体BMSCs，随访24周后发现终末期肝病模型评分均有所下降，肝功能明显好转。国内何金秋等［19］和刘卫等［20］分别报道了39例和28例终末期肝病患者接受自体BMSCs移植，分别随访至术后8周和12周，所有患者肝功能均较前明显好转。王忠等［21］对6例肝功能不全患者行肝动脉介入自体BMSCs移植后取得相似效果，且未观察到明显的并发症。近年来，国内外众多学者对自体BMSCs移植治疗肝硬化等终末期肝病患者的安全性和有效性给予了高度关注，而且其中大部分报道对此持有积极和肯定的态度［22－23］。关于BMSCs的移植途径，常见的有经门静脉、肝动脉、肝内、腹膜、脾内等。有报道显示动物模型肝内移植BMSCs更易引起肝脏炎性损害，临床实践中需引起注意［24］。4结语

目前，对BMSCs的研究还处于理论阶段，临床应用方面的研究也仅处于起步阶段，还有许多问题有待继续研究，如何才能大量获得有功能的肝样细胞，如何从细胞和分子水平子进一步阐明BMSCs的肝样分化机制，体外诱导BMSCs肝样分化的最佳条件是什么，移植干细胞如何归巢到特定位置，在体内是否有潜在的致瘤性，干细胞长期移植的不良反应和并发症等问题都还需进一步探讨。相信随着现代组织工程学的兴起，以及细胞生物学与基因工程技术的发展，BMSCs在肝脏疾病治疗领域将会发挥越来越大的作用。

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