透射电镜观测微粒给药制剂方法探讨

透射电镜观测微粒给药制剂方法探讨

高晓黎1Ξ

,季兴梅1,谢瑶芸2,汤建安2

(新疆医科大学1药学院药剂教研室,2电镜室,新疆　乌鲁木齐　830054)

摘要:目的:考察不同制样方法对透射电镜观测微粒给药制剂的影响。方法:制备含有乳剂的琼脂小胶囊,分别采用醋酸铀直接负染法、锇酸固定法及戊二醛、锇酸双重固定法,观测去氢骆驼蓬静脉注射用乳剂的微观形态;分别采用负染法和冷冻蚀刻技术制备样品,观测替加氟脂质体的微观形态。结果:先制备琼脂小胶囊,再用戊二醛、锇酸双重固定后染色,可得亚微型静脉乳的清晰图像;采用冷冻蚀刻技术制备样品,可观测脂质体微粒的三维结构构象,成像清晰。结论:应用透射电镜观测微粒给药制剂时,可根据观测对象特点,灵活选择制样方法。

关键词:透射电镜;微粒给药制剂;静脉乳;脂质体

中图分类号:Q 2336;R 94 文献标识码:A 文章编号:100925551(2003)022*******

微粒给药制剂因其自身的物理靶向性,具有定

位浓集、控制释药的特性,已引起药剂学领域的深入研究和广泛应用1。其质量控制除要符合有关制剂通则的规定外,还有自身特殊控制项目,其中形态观测和粒径分布控制是一项重要内容。一般可用光学显微镜观测,但粒径小于2Λm 时须用扫描电镜或透射电镜进行观测。为考察不同制样方法对透射电镜观测微粒给药制剂的影响,本文对不同制样方法进行了探讨。

1　材料与仪器

1.1　材料　去氢骆驼蓬碱静脉注射用乳剂(自制),替加氟脂质体(自制)。

1.2　仪器　100CX 2 型电子显微镜(日本)。

2　实验方法与结果

2.1　静脉乳　将生物体系电镜样品常用的固定与

染色技术运用于乳液样品的制备上,对文献2报道的方法进行了改进。

2.1.1　样品制备方法　用直径1mm 的细玻棒沾取3%琼脂浆,将其覆盖在玻棒表面上,待冷却后,缓缓从玻棒上剥离琼脂薄膜形成的小胶管,抽出玻棒的同时将乳剂吸入小胶管中,将小胶管平放在玻片上,两端各滴1滴热琼脂浆封口,凝固后用刀片修

整成1～2mm 长的内含乳剂的琼脂小胶囊。2.1.2　样品固定方法

2.1.2.1　无固定——直接染色法3　将被测乳剂滴在有支持膜的铜网上,稍候,滴1滴戊二醛溶液在铜网上,固定,漂洗,待快要干燥时,滴上醋酸铀溶液染色,20m in 后,电镜观察并照相。可见粒子聚集在一起,无法测量单个粒子(图1.a )。

2.1.2.2　锇酸固定法2　按上法制备含有乳剂的琼脂小胶囊,将小胶囊置于2%锇酸中固定2h ,70%～100%的丙酮梯度脱水,浸透,环氧树脂(E 2pon 812)包埋,超薄切片机切片,醋酸铀染色,电镜

观察并放大1.3万倍照相,清晰可见单个乳粒,但反差较小,粒子边缘界限较模糊(图1.b )。2.1.2.3　戊二醛、锇酸双重固定法　同上制备含有乳剂的琼脂小胶囊,随即将小胶囊浸泡入4%戊二醛溶液中固定2h ,磷酸缓冲液漂洗,1%锇酸固定1h ,漂洗,50%～100%的丙酮梯度脱水,浸透,环氧树脂(Epon 812)包埋,切片,醋酸铀染色,电镜观察并放大1.3万倍照相,可见乳粒边缘界面清晰,膜结构清楚,反差大,图像质量好,推断乳滴边缘排列着磷脂等复合乳化剂的分子层(图1.c )

。

a .直接染色法

b .锇酸固定法

c .戊二醛,锇酸双重固定法

图1　去氢骆驼蓬碱静脉乳电镜照片

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11新疆医科大学学报　JOU RNAL O F X I N J I AN G M ED I CAL UN I V ER S IT Y 2003A p r .,26(2)Ξ作者简介:高晓黎(1962-),女,教授,博士,研究方向:药物新剂型。

2.2　脂质体观测

2.2.1　负染法　通过加强标本外周密度而使生物标本显示出负的(即较透明的)反差。用以增加反差的是重金属的盐类溶液,其在标本的外周形成均质的电子不透明的环境(图2.a)。

2.2.2　冷冻蚀刻法　冷冻蚀刻技术主要由6个连续制备步骤组成:(1)标本的预处理;(2)用快速冷冻的物理方法使标本固定;(3)用预冷的刀将冻结的标本切断或裂开;(4)断裂面的蚀刻(即在真空中使冰升华);(5)对蚀刻过程暴露出的凹凸不平的表面用蒸发铂碳混合物等进行复型;(6)标本熔化后将复型漂在水面上,清洗掉附着的材料和污染杂质(图2.

b)。

由图2可见,负染法对微粒的分离效果不好,且只可见模糊外形,无法看清内部构型。而冷冻蚀刻技术,可清晰看见球形或椭圆形的脂质体结构,沿断裂面脂质体的凹凸情况不同,结合粒径结果可推断,制剂中主要为大单层脂质体。

a.负染法

b.冷冻蚀刻法

图2　替加氟脂质体电镜照片

3　讨论

目前观测生物材料超微结构主要通过3种不同的标本制备技术,即超薄切片、负染色和投影技术,运用于药剂学微粒给药制剂时,主要采用负染法4。由于负染法成像原理至今不甚清楚,制样成功率难以把握,因此对传统负染方法进行改进后用于观测亚微型静脉乳,取得良好结果,电镜图像清晰,反差大,制样成功率高。

但由于负染法制样过程中使用重金属盐类溶液,样品还要经过干燥过程,当应用于脂质体这类比较脆弱的结构时,很难成功。因此将冷冻蚀刻技术应用于样品制备过程4,此技术不需要化学固定和脱水,只需用快速冷冻的物理方法使标本固定,用预冷的刀将冻结的标本切断,将断裂面进行蚀刻,而且由于断裂沿结构上脆弱的途径进行,可清晰的观察微粒内部的三维结构构象。标本超微结构避免了重金属盐的损害,也不会因干燥而致人工皱缩,制样成功率高。因此用透射电镜法观测微粒给药制剂时,应根据观测对象的特点灵活选择样本制备方法。

参考文献:

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4　洪涛.生物医学超微结构与电子显微镜技术[M.北京:科学出版社,1980.248.

[收稿日期:2002207211

D iscussion on m ethod of em ploy i ng tran s m ission electron m icroscope(T

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to observe particles m ed ica tion agen ts

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(D ep a rt m en t of P ha r m aceu tics,S chool of P ha r m acy,X inj iang M ed ica l U n iversity,

U rum qi830054,Ch ina)

Abstract:Objective:To study the influence of differen t sam p le m ak ing m ethod in ob servati on of p articles drug m edicati on agen t w ith tran s m issi on electron m icro scop e(T E M)m ethod.M ethods:W ith m ak ing agar m icrocap su les con tain ing em u lsi on at first,negative stain ing techn ique u sing u ranyl acetate directly,tech2 811新疆医科大学学报　JOU RNAL O F X I N J I AN G M ED I CAL UN I V ER S IT Y　2003A p r.,26(2)