间接竞争ELISA检测大豆11S球蛋白和7S伴球蛋白

收稿日期:2007204201
3浙江省重大科技攻关项目(2004C12610)资助33通讯作者.E 2mail :gxy @ 彭　楠,男,1981年生,华中农业大学生命科学技术学院博士研究生,武汉430070
间接竞争E LISA 检测大豆11S 球蛋白和7S 伴球蛋白3
彭　楠　刘建峰　梁运祥　葛向阳33
(华中农业大学农业微生物学国家重点实验室,武汉430070)
摘要　采用酸沉淀、亲和层析(C onA 2Sepharose 4B )等手段,成功地分离纯化了大豆11S 球蛋白和7S 伴球蛋白,SDS 2PA GE 检测表明2种蛋白纯度分别达到95%和90%。

将纯化的11S 球蛋白和7S 伴球蛋白分别免疫大白兔获得抗血清,并建立起间接竞争EL ISA 检测大豆豆粕及其深加工产品中11S 和7S 抗原蛋白含量的方法。

关键词　11S 球蛋白;7S 伴球蛋白;亲和层析;间接竞争EL ISA 法
中图法分类号　Q 503 文献标识码　A 文章编号　100022421(2007)0520661204
大豆豆粕是饲料行业最重要的蛋白原料之一。

大豆储存蛋白主要由11S 球蛋白(大豆球蛋白)和7S 伴球蛋白(大豆伴球蛋白)组成。

11S 球蛋白由酸性亚基(A 1,2,3,4)和碱性亚基(B 1,2,3,4)组成,相对分子质量为302～375ku 。

7S 伴球蛋白通常以一种
三分子缩合物的形式存在,由α′、
α、β3个亚基组成,相对分子质量为141～190ku 。

11S 球蛋白几乎不带有糖基,而7S 伴球蛋白带有较多的糖基。

11S 球蛋白(大豆球蛋白)和7S 伴球蛋白(大豆伴球蛋白)对动物和人具有有益功能,但是这2种蛋白同时也是大豆中的主要抗原蛋白。

而且,目前还没有对大豆加工产品中这2种蛋白精确定量的方法。

鉴于动物源饲料蛋白资源短缺及安全性的问题,如何消除豆粕中的抗原蛋白从而取代动物源饲料蛋白已成为饲料行业研究的热点之一。

目前检测11S 和7S 抗原蛋白主要是通过SDS 2PA GE 中2种蛋白特征条带染色后的颜色深浅来估算其含量[1],这种方法属于定性及半定量检测,缺乏定量检测产品中11S 和7S 蛋白的方法,不利于生产企业对产品质量的监控和饲料企业对该类产品的评价和选择。

本研究首先改进了2种蛋白的纯化方法,再通过间接竞争EL ISA 法,建立了大豆豆粕及其产品中11S 球蛋白和7S 伴球蛋白精确定量的检测方法。

1　材料与方法
1.1　原料与主要试剂
脱脂大豆粉;ConA 2Sep harose 4B 购于Pharm 2macia 公司;羊抗兔Ig G 2HRP 购于PIERCE 公司;
大白兔购于华中农业大学实验动物中心;甲基2α2D 2葡萄糖苷、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、琼脂糖购于Sigma 公司;其他试剂均为分析纯试剂。

1.2　仪　器
HD 29321核酸蛋白检测仪、小型记录仪、聚苯乙
烯酶标板、D YCZ 224D 型电泳槽、BIO 2TE K 酶标仪、日立CR21G 低温高速离心机等。

1.3　大豆11S 球蛋白和7S 伴球蛋白的纯化
1)11S 球蛋白的纯化[223]。

脱脂大豆粉在p H 8.0
的T ris 2HCl 缓冲液(0.03mol/L ,含10mmol/L β2巯基乙醇)中37℃提取1h ,10000r/min (28℃)离心15min 收集上清液;用2mol/L 的HCl 将上清液p H 调至6.4,10000r/min (28℃
)离心15min ,收集得到沉淀;用亲和层析上样缓冲液(20mmol/L Tris 2HCl ,0.5mol/L NaCl ,p H 7.4)溶解沉淀后过Co 2nA 2Sep haro se 4B 柱,收集流穿部分的溶液。

2)7S 伴球蛋白的纯化[3]。

脱脂大豆粉在p H 8.0
的T ris 2HCl 缓冲液(0.03mol/L ,含10mmol/L β2巯
基乙醇)中37℃提取1h ,10000r/min (28℃)离心15min 收集上清液;用2mol/L 的HCl 将上清液p H 调至6.4,10000r/min (28℃
)离心15min ,再次收集上清液;再用2mol/L 的HCl 将上清液p H 调至4.8,
10000r/min (28℃
)离心15min 收集沉淀[3];用亲和层析上样缓冲液(20mmol/L T ris 2HCl ,0.5mol/L
NaCl ,p H 7.4)溶解沉淀后上样1.6cm ×2cm 的Co 2
第26卷第5期2007年　10月华　中　农　业　大　学　学　报
Journal of Huazhong Agricultural University Vol.26　No.5Oct.2007,661～664
nA2Sepharose4B柱,先用亲和层析上样缓冲液洗脱至流穿溶液吸光值回到基线后,用亲和层析洗脱液(0.6mol/L甲基2α2D2葡萄糖苷,20mmol/L T ris2 HCl,0.5mol/L NaCl,p H7.4)洗脱,收集对应的洗脱溶液。

1.4　SDS2PAGE检测大豆11S球蛋白和7S伴球蛋白纯度
参照文献[4],分离胶浓度为12%,浓缩胶浓度为5%,考马斯亮蓝G2250染色。

1.5　制备11S球蛋白和7S伴球蛋白的抗血清
参照文献[526]以健康雄性新西兰大白兔作为实验动物制备抗血清。

盐析法纯化抗体,小量分装冷冻干燥保存。

1.6　间接竞争E LISA检测11S球蛋白和7S伴球蛋白[7]
1)间接EL ISA检测11S球蛋白和7S伴球蛋白抗血清的效价。

在酶标板上,横排做抗原蛋白10、8、6、4、2、1、0.5、0μg/mL系列梯度包被,纵排做抗体1∶5000、1∶10000、1∶20000、1∶40000、1∶60000、1∶80000稀释的系列梯度与包被抗体反应,以OD450nm≥1.0的点所对应的抗体稀释度作为抗体效价。

2)间接竞争EL ISA检测大豆11S球蛋白和7S 伴球蛋白最佳工作条件的确定。

采用棋盘滴定法,将抗原、抗体的最适工作浓度确定出来。

以OD450nm≥1.0的点所对应的抗原最高稀释度作为抗原的最适包被浓度,抗体最高稀释度作为抗体的最适工作浓度。

3)间接竞争EL ISA测定大豆11S球蛋白和7S 伴球蛋白标准曲线的建立。

将大豆11S球蛋白和7S 伴球蛋白稀释至本文1.6中2)确定的最适包被浓度,每孔100μL包被于聚苯乙烯酶标板中,4℃放置过夜,洗涤3次;加入1%BSA封闭1h后,洗涤3次;将50μL作一系列稀释的标准抗原溶液和参照液(即洗涤液)与等体积最适稀释度的抗体加入聚苯乙烯酶标板中混合,37℃孵育,每个标准抗原浓度和参照液作6个重复;洗涤3次后;加入1∶10000稀释的羊抗兔IgG2HRP,每孔100μL,37℃反应1h;洗涤5次后每/孔加入底物溶液100μL。

避光显色10～15 min,每孔加入50μL2mol/L H2SO4的终止液,在酶标仪上测定各孔的OD450nm值,计算各个抗原浓度的抑制率。

抑制率的计算公式为:抑制率I(%)=[(参照孔OD450nm值-待测孔OD450nm值)×100]/参照孔
OD450nm值。

以抑制率为纵轴,抗原浓度的对数为横轴,绘制标准曲线,得到线性方程。

4)间接竞争EL ISA检测发酵豆粕饲料产品11S球蛋白和7S伴球蛋白含量。

各取1g过孔径0.45mm筛的发酵豆粕粉与20mL p H8.0的0.03 mol/L Tris2HCl缓冲液混合,37℃提取1h,10000 r/min(28℃)离心15min收集上清液,将上清液蛋白质浓度稀释至间接竞争EL ISA标准曲线范围内,采用本文1.6中3)的方法计算抑制率,再根据标准曲线分别计算出11S蛋白和7S蛋白的含量。

1.7　11S蛋白抗血清和7S蛋白抗血清与大豆蛋白的交叉反应
将分别按最佳包被浓度稀释的11S蛋白和7S 蛋白包被反应孔,过夜,每个蛋白6孔,每孔100μL。

次日洗板之后,在包被11S蛋白的3个孔中加入按最佳稀释度稀释的11S蛋白抗血清100μL,另外3个孔中加入按最佳稀释度稀释的7S蛋白抗血清100μL;在包被7S蛋白的3个孔中加入按最佳稀释度稀释的7S蛋白抗血清100μL,另外3个孔中加入按最佳稀释度稀释的11S蛋白抗血清100μL。

孵育1h后洗板,加底物显色10min终止反应,读取OD450nm。

按照11S蛋白与11S蛋白抗血清反应OD450nm为100%,计算7S蛋白抗血清与11S 蛋白的交叉反应率;按照7S蛋白与7S蛋白抗血清反应OD450nm为100%,计算11S蛋白抗血清与7S 蛋白的交叉反应率[8]。

2　结果与分析
2.1　亲和层析纯化11S球蛋白和伴球7S蛋白
亲和层析洗脱图见图1,峰1和2分别对应11S球蛋白和7S伴球蛋白:根据本文1.3中1)方法收集峰1对应的溶液即为11S球蛋白;根据本文1.3中2)方法收集峰2对应的溶液即为7S 伴球蛋白。

2.2　SDS2PAGE检测11S球蛋白和7S伴球蛋白的纯度
根据本文1.3方法,得到纯化的11S球蛋白和7S伴球蛋白,电泳检测结果(图2)显示:11S球蛋白纯度达到95%,7S伴球蛋白的纯度达到90%。

2.3　抗血清效价的确定
根据棋盘滴定法的结果,11S球蛋白抗血清效价为1∶40000,7S伴球蛋白抗血清效价为1∶20000。

266 华中农业大学学报第26卷　
图1　ConA 2Sepharo se 4B 亲和层析图谱
Fig.1　The image of affinity chromatography using a Con 2
A 2Sepharose 4
B colomn
1.流穿峰Flow t hrough (unbound material );
2.洗脱峰Eluted
target ;A.上样缓冲液Binding buffer ;B.洗脱液Elution
buffer
图2　11S 蛋白和7S 蛋白电泳图
F ig.2　The SDS 2PAGE image of 11S globulin and 7S conglycinin
1.低分子量蛋白质marker Protein marker ;
2.p H 6.4沉淀得到
的11S 蛋白11S globulin by p H 6.4acid precipitation ;3.亲和层析纯化的11S 蛋白11S globulin by affinity chromatography ;4.p H 4.8酸沉淀的蛋白Protein by p H 4.8acid precipitation ;5,6.亲和层析纯化的7S 蛋白7S conglycinin by affinity chromatography ;7.原豆粕蛋白Protein from defatted soybean meal
2.4　抗原抗体最佳工作浓度的确定
11S 球蛋白最佳包被浓度为1μg/mL ,11S 球蛋白抗体最佳稀释度为1∶40000;7S 伴球蛋白最佳包被浓度为2μg/mL ,7S 伴球蛋白抗体最佳稀释度为1∶20000。

2.5　间接竞争E LISA 法检测11S 球蛋白和7S 伴
球蛋白线性方程的建立 2种蛋白检测过程中竞争反应30min 线性最好。

11S 球蛋白的线性抑制方程为:抑制率I =27.735lg C 214.513,R 2=0.9987(C 为11S 蛋白浓
度:ng /mL )。

将抑制率在20%～80%作为可信区间,检测范围在18～2560ng/mL ;7S 伴球蛋白的线性抑制方程为:抑制率I =37.836lg C 247.709,
R 2
=0.9964(C 为7S 蛋白浓度:ng/mL )。

将抑制率在20%～80%作为可信区间,检测范围在60～2370ng/mL 。

2.6　间接竞争E LISA 检测10个发酵豆粕饲料产品11S 球蛋白和7S 伴球蛋白含量
根据本文1.6中4)方法,用间接竞争EL ISA
检测结果见表1。

对国内外豆粕发酵饲料的检测结果表明:国内豆粕饲料在消除11S 和7S 抗原蛋白方面质量参差不齐,而国内优秀的豆粕饲料产品的质量和国外及台湾的发酵豆粕饲料产品差别不大。

表1　10个发酵豆粕样品中11S 蛋白和7S 蛋白的含量
T able 1　The content of 11S globulin and 7S conglycinin in ten
zymolytic defatted soybean samples
mg/g
样品
Samples 1)
11S 球蛋白含量Protein content of 11S glycinin
7S 伴球蛋白含量Protein content of 7S conglycinin
1
2.01 1.14211.4810.72336.363
3.96412.0410.32526.742
4.98621.3819.977 1.520.86A
2.72 1.54Ⅰ 2.70 1.32Ⅱ
5.23
2.82
　1)1,2,3,4,5,6,7分别代表我国某公司发酵豆粕产品Sample 1,
2,3,4,5,6,7:zymolytic defatted soybean product s from China ;A.代表中国台湾某公司发酵豆粕产品Sample A :zymolytic defatted soybean product from T aiwan ,China ;Ⅰ,Ⅱ.分别代表欧洲某公司发
酵豆粕产品Sample Ⅰ,Ⅱindicate zymolytic defatted soybean product s
from Europe
2.7　11S 蛋白抗血清和7S 蛋白抗血清与大豆蛋白
的交叉反应 试验结果(表2)表明:11S 蛋白抗血清特异性较
好;而7S 蛋白抗血清与11S 蛋白交叉反应达37%。

主要是由于:(1)免疫家兔的7S 蛋白中有10%的表2　11S 蛋白抗血清和7S 蛋白抗血清与大豆蛋白交叉反应T able 2　C ross 2reaction d ata for 11globulin serum and 7S conglycinin
serum against 7S conglycinin and 11globulin serum
%
大豆蛋白
Soybean protein 交叉反应率Cross 2reaction
11S 抗血清
11S antiserum
7S 抗血清7S antiserum
11S 蛋白glycinin 100377S 蛋白β2conglycinin
18
100
3
66　第5期彭　楠等:间接竞争EL ISA 检测大豆11S 球蛋白和7S 伴球蛋白　
11S蛋白,造成抗血清中有11S蛋白抗体;(2)7S蛋白具有部分11S蛋白的表位,造成7S蛋白抗血清(多克隆抗体)中部分抗体识别11S蛋白[8]。

而大豆中的其它蛋白,如α2conglycinin(2S球蛋白)、γ2con2 glycinin和15S多聚体暂时不能纯化,所以不能检测其与11S蛋白抗血清和7S蛋白抗血清的交叉反应。

3　结　论
本研究改进了11S球蛋白和7S伴球蛋白的纯化和定量检测方法,新方法比SDS2PA GE法[1]更加准确;制备了抗11S球蛋白和7S伴球蛋白多克隆抗体,效价分别达到1∶40000和1∶20000;确定了最佳抗体、抗原工作浓度并建立了检测豆粕11S蛋白和7S蛋白含量的间接竞争EL ISA线性方程。

间接竞争ISA检测大豆11S球蛋白和7S伴球蛋白方法主要的缺点在于由于抗原蛋白之间存在共同的部分表位以及多克隆抗体本身的缺点会造成检测误差,因此如果采用抗11S蛋白和7S蛋白的单克隆抗体,检测结果将更加接近真实值。

另外检测方法的重复性、稳定性还有待进一步验证;免疫和检测用的7S蛋白的纯度还需要进一步提高。

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Q uantitative Analysis of Soybean11S G lobulin and7S Conglycinin
by Indirect Inhibiting E L ISA Method
PEN G Nan　L IU Jian2feng　L IAN G Yun2xiang　GE Xiang2yang
(S tate Key L ibratory of A g ricult ural M icrobiolog y,H uaz hong A g ricult ural U ni versit y,
W uhan430070,Chi na)
Abstract　An indirect inhibiting EL ISA met hod for t he quantification of11S(glycinin)and7S pro2 tein(beta2conglycinin)was developed.First,soybean11S globulin and7S conglycinin were separated successf ully by acid p recipitation and affinity chromatograp hy using a Con A2Sep harose4B column.The result of SDS2PA GE indicated t hat t hese two p roteins were highly refined wit h95%and90%p urifica2 tion.The antiserums from rabbit s against t he refined11S globulin and7S conglycinin were used for quantifying t hese two p roteins in zymolytic defatted soybean and t he deeply processed product s by indi2 rect inhibiting EL ISA met hod.
K ey w ords　11S glo bulin;7S conglycinin;affinity chromatograp hy;indirect inhibiting EL ISA met hod
(责任编辑:张志钰) 466 华中农业大学学报第26卷　。