DKK1与肿瘤发展

DKK1与肿瘤发展
Wnt信号通路通过促进肿瘤细胞转化、生长、侵袭转移和血管生成等过程在肿瘤发生发展过程中扮演着关键角色，已成为目前肿瘤研究的热点[1]。

作为Wnt 信号通路中重要的分泌型抑制因子，DKK1在肿瘤中的作用亦得到了逐步重视。

最新研究表明，分泌性蛋白DKK1（dickkopf-1）在多种肿瘤存在明显表达异常，并且其表达与肿瘤的病理分期及预后存在明显的相关性，提示DKK1有可能成为一个新的肿瘤标志物和治疗靶点，在肿瘤的诊断、治疗和复发监测中发挥重要作用[2-4]。

在此本文就DKK1的结构、在肿瘤发生发展、诊断及治疗中的作用及其研究前景进行综述。

1 DKK1基因的发现及结构特点
DKK1为Dickkopf基因家族成员。

1998年Andrei Glinka等在研究Xenopus 胚胎头部发育诱导机制的过程中首次发现、克隆并定义了DKK1及其家族，并发现DKK1是诱导胚胎头部发育的关键因子[5]。

为了进一步研究其在人类胚胎发育中的作用，1999年Fedi P等[6]克隆了人类的DKK1基因。

人类DKK1基因位于10q11.2，约3.5kb，编码一个长约266个氨基酸、分子量大小為28.7KDa 的分泌型糖蛋白[7]。

在胚胎时期，DKK1在肾脏中表达最强，其次为肝脏和脑部；在出生后，主要表达于胎盘和前列腺中[8]。

DKK1蛋白的亚细胞定位主要位于胞浆，结构上包含一个N端的信号序列、两个保守的富半胱氨酸区域（Dkk_N和辅脂肪酶折叠区域）和一个靠近蛋白质C端的N-糖基化位点。

其中信号序列由20～30个氨基酸组成，负责DKK1肽链穿越粗面内质网膜和介导DKK1分泌至细胞外[8]；辅脂肪酶折叠区域是由一个多个短的β折叠和二硫键构成的类指结构，可与Wnt受体LRP5/6及另一类穿膜蛋白Kremen1/2结合形成三聚体、诱导其内吞而抑制Wnt信号通路，是DKK1蛋白发挥功能的平台[9-11]；Dkk_N区域为一个包含有一个保守半胱氨酸序列的富半胱氨酸区域，其在Dickkopf蛋白中位置的变化不但是Dickkopf家族不同成员间相互区别的标志，也是调节Dickkopf家族蛋白对Wnt信号通路正向或负向调控的关键结构[12]。

DKK1的转录调节机制非常复杂，除Wnt信号途径本身能通过β-catenin诱导DKK1表达对其自身进行负反馈调节外[13]，野生型p53[14]、糖皮质激素[15]、孕激素[16]、DNA损伤[17]等均可诱导DKK1的表达，其精确的调节机制仍待进一步探讨。

2 DKK1的生物学功能
Wnt信号通路是细胞信号通路中最经典、最重要的信号通路之一，广泛参与了细胞的增殖、凋亡、细胞迁移及血管发生等过程，不仅在胚胎发育调控过程中发挥着中枢作用，而且与肿瘤的发生发展也具有密切关系[18]。

DKK1作为Wnt 信号通路的重要调节因子，亦广泛参与了上述过程并对其产生着重要影响。

2.1 DKK1与细胞凋亡细胞凋亡（apoptosis）又称生理性细胞死亡（physiological cell death，PCD）是指机体为更好地适应生存环境，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。

正常的细胞凋亡在胚胎时期能清除多余的和已完成使
命的细胞，维护胚胎的正常发育；在出生后能清除衰老和病变的细胞，保护机体的健康，是促进生物体进化、维持机体内环境的稳定和胚胎正常发育的重要机制。

P53、c-myc、Bcl-2家族、Caspase家族等是调节细胞凋亡的主要基因[19]。

上述基因表达失调或功能缺陷可导致细胞凋亡抑制而有利于肿瘤细胞的恶性转化和增殖，是肿瘤发生发展的重要机制。

最近研究表明，DKK1在促进肿瘤细胞凋亡过程中发挥着重要作用。

2000年美国佐治亚州立大学Jian Wang等[14]通过cDNA 消减杂交技术发现在P53过表达的人肺腺癌细胞系H1299中存在DKK1表达明显上调。

对DKK1的转录启动子序列的进一步研究表明，在DKK1转录起始部位上游2.1 kb处存在P53蛋白的结合位点，并且只有野生型的P53而不是突变型P53能激活DKK1的转录，说明P53可能通过诱导DKK1的表达而抑制Wnt 信号通路、发挥其抑癌基因作用。

2002年Jiang Shou等[17]进一步研究发现，在胶质母细胞瘤U87MG中转染DKK1表达质粒后可明显促进烷化剂BCNU、卡铂、喜树碱等诱导的细胞凋亡，细胞的凋亡与DKK1表达水平呈明显负相关。

并且DKK1的过表达可降低胞内β-catenin和出现细胞端粒的缩短和活性降低，说明DKK1可通过对Wnt/β-catenin经典信号通路和端粒活性的调节而促进细胞凋亡。

除了通过Wnt/β-catenin之外，DKK1还能通过Wnt/JNK等信号通路诱导细胞凋亡。

2004年Amie Y. Lee等[20]建立了β-catenin表达缺失的间皮瘤细胞H28 DKK1过表达模型。

发现即使在β-catenin表达缺失的情况下，DKK1的过表达仍然能有效地促进H28细胞的凋亡，并且其凋亡水平与DKK1过表达的肺癌细胞系H450（有β-catenin表达）相似，且均存在Wnt信号通路转录调节基因DVL-3和suvivin的表达下调。

但间皮瘤细胞H28的凋亡在加入JNK特异的阻断剂SP600125后明显下降。

说明DKK1能通过Wnt/β-catenin、Wnt/JNK等多条信号通路的途径调控细胞凋亡。

DKK1促凋亡功能的缺失可能是部分肿瘤发生发展的重要机制。

2.2 DKK1与细胞增殖细胞过度增殖是肿瘤的主要特征，其机制主要来源于3个方面：细胞周期失控、生长接触性抑制的丧失和定着依赖性（anchorage dependence）的丧失。

恢复肿瘤细胞的正常细胞周期、接触性抑制和定着依赖性可以达到抑制肿瘤生长、增殖，是目前肿瘤研究的热点。

在肿瘤细胞中，过度激活的Wnt信号可通过上调C-MYC、Cyclin D1和下调细胞粘附因子而达到促进细胞周期失控、生长接触性抑制和定着依赖性的丧失的目的。

作为Wnt信号的调控因子，DKK1在调节细胞的增殖过程中扮演这双重角色。

在部分细胞中，DKK1是刺激细胞从生长停滞期进入对数生长期的关键蛋白。

早在1997年Bruder 等学者就发现在体外培养人间充质干细胞（hMSCs）的过程中，hMSCs在进入对数生长期前都要经历3～5 d的生长停滞期，而将处于对数生长期的hMSCs的培养基加入刚替换新鲜细胞培养基的hMSCs中可促进其分裂增殖，这说明在对数生长期的hMSCs的培养基中存在某种刺激因子能促进hMSCs分裂增殖。

为进一步明确其机制，2003年Carl A. Gregory 等采用包含[35S]-甲硫氨酸的培养对hMSCs进行培养，以标记和监测在细胞培养基中新出现的分泌性蛋白。

结果显示，DKK1在hMSCs由生长停滞期进入对数生长期的过程中明显升高，并在hMSCs生长进入稳定期后逐渐降低。

说明DKK1可能在诱导hMSCs分裂增殖的过程中发挥了重要作用。

为了进一步验证这一设想，Carl A. Gregory等在处于生长停滞期的hMSCs培养基中加入了人工合成的DKK1蛋白。

结果显示该培养基中hMSCs的增殖明显早于培养基中未加入DKK1蛋白的hMSCs，并且增殖速度
明显增快。

对hMSCs增殖前后的cDNA芯片及免疫荧光检测显示，当hMSCs 培养基加入DKK1蛋白后，其核内及细胞骨架上的β-catenin的表达明显减少，并出现JNK信号通路活性明显减低及血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）表达下降。

而在hMSCs培养基中加入DKK1抗体能明显抑制hMSCs细胞的分裂增殖。

说明对于hMSCs DKK1可通过抑制Wnt/β-catenin和Wnt/ JNK信号通路并通过降低细胞粘附抑制接触性抑制而促进hMSCs的分裂增殖。

为了进一步验证其对肿瘤细胞增殖的调控，Carl A. Gregory 等将DKK1抗体加入存在DKK1蛋白表达骨肉瘤细胞系（MG-63）的培养基中，MG-63细胞系的生长停止，说明DKK1是影响该类肿瘤细胞增殖的关键因素。

与上述现象不同的是，在后来的研究中也有学者发现，DKK1能抑制多种DKK1表达缺失的肿瘤细胞的生长尤其是锚定非依赖性的生长，如宫颈癌细胞系Hela、黑色素瘤细胞MDA-MB435、间皮瘤细胞系H28[20]、绒毛膜癌细胞系JEG3等。

并且这些细胞在过表达DKK1后，裸鼠成瘤能力明显下降。

从上述研究中可以看出，DKK1对细胞生长的调控在不同的细胞中作用是不同的，这种差异可能是由于各类细胞中DKK1及其他基因的表达谱差异而造成。

2.3 DKK1与细胞迁移细胞迁移是细胞发挥其生理功能关键过程。

在胚胎发育过程，对胚胎细胞迁移的适时诱导是胚胎体轴发育、神经系统发育、肢体发育等过程的关键机制；而出生后体细胞的适时迁移有利于机体的生长、免疫和自我修复功能。

Wnt信号通路是调节细胞迁移的关键信号通路之一，它能通过诱导上皮间充质细胞转化（EMT）关键基因MMP7、MT-MMP的表达而促进细胞运动、降低细胞与基质间的粘附，并能通过促进血管生成相关因子C0X-2、VEGF的表达上调，诱导肿瘤血管生成，为肿瘤的生长、转移提供营养和转移路径。

DKK1通过对Wnt信号途径的负调控，对细胞的侵袭转移产生了重要影响。

2006年Jurgen Pollheimer等研究了DKK1对滋养层母细胞SGHPL-5的迁移能力的影響。

结果显示，在SGHPL-5培养基中加入DKK1后，SGHPL-5 在Transwell实验中的运动能力明显下降，迁移细胞数由（240%±35%）降至（58%±31%），并且SGHPL-5细胞内Cyclin D1表达水平降至39%，β-catenin表达水平降至41%。

说明DKK1能够通过负调控Wnt信号通路降低细胞的迁移能力。

但有趣的是，Takumi Yamabuki等[3]发现在将DKK1过表达质粒转染入成纤维细胞系NIH3T3和COS-7后，却能明显促进上述细胞在Transwell实验中的侵袭能力。

进一步证明了，细胞信号通路是一个复杂的网路系统，DKK1作为Wnt信号通路的细胞外上游作用因子，其功能很可能由于不同细胞间基因的表达差异和突变导致功能存在巨大差异。

2.4 DKK1在人类肿瘤中的表达及其与肿瘤临床病理特征及预后的关系与DKK1生物学功能在不同细胞间存在差异相似的是，在不同肿瘤类型中DKK1表达水平及功能亦存在巨大变化。

目前研究显示，在恶性黑色素瘤和结肠癌组织[2]中DKK1表达水平明显下降。

由于Wnt信号途径在结肠癌的发生发展过程中扮演着核心角色，作为Wnt 信号途径的重要抑制因子，DKK1在结肠癌的表达调节机制及作用得到了较深入的探讨。

2005年Gonza lez-Sancho1 JM等[2]在研究结肠癌组织中DKK1表达规律的过程中发现，Wnt/β-catenin信号途径的激活虽然能促进人宫颈癌细胞系hela
细胞和人胚胎肾293细胞中DKK1的表达，但在32例结肠癌患者组织中却并未发现DKK1的表达上调，甚至在部分病例还出现明显的下调（15/32）。

为了进一解释这一现象，2006年O Aguilera等[2]对9种结肠癌细胞系DKK1基因启动子区域的甲基化水平进行了检测，发现存在DKK1低表达的结肠癌细胞系均存在启动子区域CpG岛的高度甲基化，并且发现DKK1启动子区域CpG岛的高度甲基化仅存在DUCK’s C期和D期来源的细胞系。

在54例结肠癌标本中，9例DKK1启动子区域CpG岛甲基化的肿瘤亦仅见于DUCK’s C期和D期的患者，而Duke’s B患者DKK1启动子区域无甲基化。

并且在结肠癌细胞系DLD-1中过度表达DKK1能抑制明显该细胞的增殖和皮下成瘤能力。

这些都说明DKK1的表达下调可能是促使结肠癌发生发展的重要原因，启动子甲基化可能是导致DKK1在结肠癌中表达下调的重要机制。

但同时我们也应该注意到，在54例结肠癌标本中有45例并未存在启动子的甲基化，这说明在结肠癌的发生发展过程中DKK1的表达还存在除甲基化外的其他调节机制。

與上述肿瘤相反的是DKK1在乳腺癌[3]、肺癌、食管鳞癌[4]、肝细胞癌、肝母细胞瘤和Wilms瘤中表达水平明显增高。

M-A Forget等[3]发现DKK1在乳腺癌组织中的表达明显高于相应正常乳腺组织（21/73），且主要表达于ER-/PR-、有腋窝淋巴结转移和有乳腺癌家族史的患者乳腺癌组织中。

而在各类乳腺癌中，ER-/PR-乳腺癌组织中DKK1的表达明显高于ER+/PR-和ER-/PR+的乳腺癌组织；在具有腋窝淋巴结转移尤其是有10个以上腋窝淋巴结转移的患者，其表达水平更高。

并且肿瘤TNM分期越晚，乳腺癌组织中DKK1的表达水平越高，ⅢC期患者乳腺癌组织的DKK1表达阳性率为100%。

预后分析显示，DKK1阳性表达的乳腺癌患者相对于DKK1表达阴性的患者预后更差。

这些都说明，在乳腺癌组织中DKK1的表达与ER和PR受体相关的分子分型有关，其表达上调可能预示着乳腺癌的不良预后，并且DKK1可能参与了乳腺癌的遗传发生机制。

与上述发现相同的是，Takumi Yamabuki 等[4]在肺癌和食管鳞癌的cDNA芯片结果中亦发现DKK1在肿瘤组织的表达水平明显高于相应的正常组织。

且在肺癌组织中DKK1表达水平越高，患者生存期越短。

尤其有意义的是，多因素回归分析结果显示DKK1是除年龄、分化程度和TNM分期外，影响肺癌患者预后的一个独立危险因素。

在280例食管癌患者癌组织标本的免疫组化检测中，DKK1高表达组食管鳞癌患者中位生存时间明显低于低表达组患者。

这些说明DKK1可能在肺癌和食管鳞癌的发展过程中发挥促癌基因的作用。

DKK1在多种肿瘤中的显著表达差异及其分泌蛋白的特性使其有可能成为一个新的血清诊断学指标用于肿瘤的诊断、复发检测和预后分析。

目前人们已发现其在恶性黑色素瘤、多发性骨髓瘤、肺癌、胃癌、肝癌等多种肿瘤患者血清中表达明显上调，并且其表达与肿瘤的分期、复发转移、预后存在明显相关性。

尤其是在甲胎蛋白表达阴性的肝癌患者中，其诊断敏感性为70.4%、特异性为90%，并可从甲胎蛋白阳性的慢性乙型肝炎及肝硬化等高危患者中鉴别诊断肝细胞癌，鉴别诊断敏感性达69.1%、特异性为84.7%。

DKK1蛋白与甲胎蛋白联合应用，可将肝细胞癌总体诊断率提高至88%。

DKK1这一特性对于提高早期肝癌诊断率，检测肝癌术后复发转移具有重要意义，成为肝癌血清学诊断中一个新的重要指标。

3结论
综上所述，DKK1作为Wnt信号途径的抑制因子，广泛参与了细胞生长、凋亡及细胞运动的调节，其在肿瘤细胞的表达变化对肿瘤细胞的生物学行为产生了重要影响，并且与肿瘤的临床病理特征及预后有着重要的联系。

这说明DKK1的异常表达与肿瘤发生发展的存在广泛的关联，其在肿瘤中表达特异性高，易于检测的特点使其有可能成为良好的肿瘤诊断指标及治疗靶点，进一步深入研究其调控机制及肿瘤诊治过程中价值，对于完善肿瘤发生发展机制，指导肿瘤治疗，改善患者远期预后将具有重要意义。

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編辑/张燕。