红茶菌发酵液抑菌作用研究
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中国病原生物学 J ournal of Pathogen B
杂志 iolog y
2008
Dece
年 12 月 第 3 mber 2008 , Vol
卷第 12 . 3 , No .
期 12
·论著 ·
红茶菌发酵液抑菌作用研究
张玉梅1 , 房卫刚2 , 李波清1 3 , 张珍1
(1. 滨州医学院烟台校区病原生物教研室 ,山东烟台 264003 ;2. 滨州医学院 2003 级生物技术专业本科学生 ,山东烟台 264003)
【摘要】 目的 研究不同 p H 值下红茶菌发酵液及其蛋白提取液的抗菌作用 ,为探寻新的抗菌物质奠定基础 。 方法 采用 K2B 纸片扩散法检测不同 p H 值下红茶菌发酵液及不同量的蛋白提取液分别对大肠埃希菌 、金黄色葡萄球菌和白 色念珠菌的抑菌作用 。 结果 红茶菌发酵液在酸性条件下对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的生长具有明显的抑制作 用 ,而在碱性条件下均未表现出抑制作用 ;红茶菌蛋白提取液对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌有抑菌活性 ,红茶菌发酵 液及蛋白提取液对白色念珠菌无明显抑菌作用 。 结论 红茶菌发酵液具有明显的抑制金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌 生长的作用 。红茶菌发酵产生的蛋白质类物质是红茶菌液中的抑菌活性成分之一 ,具有用作食品抑菌剂的潜在价值 。 【关键词】 红茶菌 ; 抑菌作用 ; 纸片扩散法 ; 抑菌蛋白 【中图分类号】 R378 【文献标识码】 A 【文章编号】 167325234 (2008) 1220890202
December
月 第 3 2008 , Vol
卷第 12 . 3 , No .
期 12
·891 ·
2 %的量接种红茶菌菌种 ,摇匀 ,用 6 层纱布封口 ,移入 30 ℃电热恒温箱中发酵 。分别取发酵 2 周和 3 周的 发酵液 ,过滤除去红茶菌膜和其他较大的杂质 ,然后 4 ℃4 000 r/ min (离心半径 30 cm) 离心 30 min ,上清液 用 0. 2μm 微孔滤膜过滤器过滤除菌 。取除菌后的发 酵液灌装于灭菌后的青霉素小瓶中 ,每瓶 3 ml ,分别 用 1 mol/ L 的 NaO H 和 HCl 调节酸碱度 ,得到 p H 值 为 1. 0 、4. 0 、7. 0 和 10. 0 的发酵液 。 5 红茶菌蛋白提取液制备
高速冷冻离心机 (BAC KMAN 公司) 、生物安全柜 (苏 净集团安泰公司) 及全自动高压灭菌器 ML S23780 (日 本 SAN YO 公司) 等 。 3 供试菌的复苏和浓度测定
划线接种法将菌种接种于平板 ,37 ℃培养 24 h ; 挑取单菌落接种于液体培养基 ,白色念珠菌 28 ℃,金 黄色葡萄球菌和大肠埃希菌 37 ℃摇床培养 16 h～18 h 。用分光光度计测定各菌液 A600 值 ,并用无菌培养基 调 A600 值为 0. 5 。 4 红茶菌发酵液的制备
[ J ournal of Pat hogen B iolog y . 2008 Dec ; 3 (12) : 890 - 891 ,902. ]
Bacteriostasis of black tea f ungus broth ZHAN G Yu2mei1 , FAN G Wei2gang2 , L I Bo2qing1 , ZHAN G Zhen1 (1. De partment of Pat hogenic organ2
ism , B i nz hou Medical Col lege , Yant ai 264003 , S han don g , Chi na; 2. Technolog y 2003 un der g ra d uate st u dent , B i nz hou Me dical Col le ge , Yant ai 264003 , S hsn don g , Chi na)
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
中国病原生物学 J ournal of Pathogen B
杂志 iolog y
2008 年 12
【Abstract】 Objective To explore t he antibacterial activity of black tea f ungus brot h and p rotein ext ract under different p H values and lay t he fo undation fo r t he new antibacterial substances. Methods KB disk diff usio n met hod was used in different p H values under t he black tea f ungus brot h and different amount s of p rotein ext ract , respectively Escherichi a co2 li , S t a p hy lococcus au reus and Can di d a albicans t he antimicrobial effect . Results Black tea f ungus brot h has apparent antibacterial activity against E. coli and S. aureus in acid environment and no antibacterial activity in alkaline enviro nment was fo und. Meanwhile t he p rotein ext ractio n of black tea f ungus has visible antibacterial activity to t hem. But bot h black tea f ungus brot h and it s p rotein ext ractio n has no antibacterial activity to C. albicans. Conclusion Black tea f ungus brot h has apparent antibacterial activity against E. coli and S . aureus. Protein2like substances p roduced f rom black tea f ungus is o ne of t he active ingredient s , and it has potential value as bacterial inhibitor on food vocatio n. 【Key words】 Black tea f ungus ; bacterio stasis ; Kribry2Bauer met hod ; inhibitory p rotein
选用上等红茶 ,按 1 %的量加入蒸馏水中 ,加热煮 沸 10 min ;按 8 %称取蔗糖 ,加入刚煮好的茶水中 ,搅 拌至完全溶解 ,过滤于锥形瓶中 ,冷却到 50 ℃以下 ;按
3 【通讯作者】 E2mail : sdliboqing @163. co m 【作者简介】 张玉梅 (1981 - ) ,女 ,硕士 ,助教 ,主要从事细菌分 子生物学的研究 。E2mail : meiyuzh @163. co m
结 果
1 不同 p H红茶菌发酵液对实验菌的抑菌作用 红茶菌液对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的抑菌
效果在 p H 1. 0～5. 0 范围内随着 p H 值降低而增强 ( P < 0. 01) ,p H5. 0 时抑菌环直径最小 ,为 (7. 52 ± 0. 025) mm ,p H1. 0 时抑菌环直径最大 , 为 ( 8. 71 ± 0. 095) mm ,抑菌效果见表 1 、2 。p H7. 0 和 10. 0 时的 红茶菌液对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌无抑菌作 用 ,不同 p H 的红茶菌液对白色念珠菌均无抑菌作用 。 2 不同量红茶菌蛋白提取液对实验菌的抑菌作用
采用三氯醋酸/ 丙酮沉淀法 。向盛有 1 ml 红茶菌 液的大离心管中缓慢加入 4 ml 冷的 50 %三氯醋酸 丙酮溶液 (三氯醋酸的提取浓度相当于 40 %) , - 20 ℃ 静止 1 h ,然后 4 ℃下 (离心半径 30 cm) 10 000 r/ min 离心 15 min ,弃上清液 。用丙酮乙醚 (1 ∶1) 混合液重 新悬浮沉淀物同法离心 15 min ,弃上清液 ,沉淀物风 干后用 p H7. 0 的磷酸盐缓冲液溶解 ,4 ℃保存备用 。 6 纸片扩散法检测红茶菌发酵液及蛋白提取液的抑 菌作用 6. 1 抑菌作用测定 将直径 6. 0 mm 的滤纸片灭菌 干燥后备用 ,取培养至对数期的细菌 ,分别取 A600 为 0. 5 的大肠埃希菌 、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌菌 液 0. 1 ml ,涂布直径为 90 mm 的培养基平板 ,再将药 敏纸片贴到平板上 ,白色念珠菌 28 ℃,金黄色葡萄球 菌和大肠埃希菌 37 ℃恒温箱培养 18 h ,按文献[ 3 ]的 方法测定抑菌环直径 。 6. 2 不同 p H 红茶菌发酵液抑菌实验 设置 p H 值 为 1. 0 、2. 0 、3. 0 、4. 0 、5. 0 、7. 0 和 10. 0 5 个不同 p H 平 板实验组 ,红茶菌液加样量均为 50μl ,每组重复 3 次 , 记录不同 p H 平板上的抑菌结果 。所得数据统计学处 理采用方差分析 。 6. 3 不同量蛋白提取液抑菌实验 以 p H7. 0 的 PBS 缓冲液为空白对照 ,以不同量的红茶菌蛋白提取液做 抑菌试验 ,每组重复 3 次 ,记录不同 p H 平板上的抑菌 结果 ,所得数据统计学处理采用方差分析 。
in different pH to St a p hylococcus a ureus
抑菌环直径 Diameters of the antibacterial ring (mm)
pH
抑来自百度文库环 1
抑菌环 2
抑菌环 3
Antibacterial ring 1 Antibacterial ring 2 Antibacterial ring 3
(A S 1. 1476) 和白色念珠菌 (2. 2411) 均由本研究室保 藏 。红茶菌培养基 :绿茶 、蔗糖和蒸馏水按 1 ∶8 ∶100 混合 ,煮沸 10 min 。实验菌培养基采用 LB 培养基[2] 和沙保弱培养基 。 2 实验仪器
电热恒温培养箱 (上海跃进公司) 、气浴恒温振荡 器 (山西荣华公司) 、p H 计 (北京海淀航天仪器公司) 、
空白对照组无抑菌环产生 ,不同量的红茶菌蛋白
提取液对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌具有明显的抑
菌作用 ,且抑菌作用随着用量增大而加强 ( P < 0. 01) 。
对白色念珠菌均无抑菌作用 。18 h 后观察红茶菌蛋
白提取液对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的抑菌效果
见表 3 、4 。
表 1 不同 pH的红茶菌液对金黄色葡萄球菌的抑菌作用 Table 1 Bacteriostasis of black tea f ungus broth
红茶菌又名海宝或胃宝 ,是我国民间广为流行的 一种传统酸性保健饮料[1] 。红茶菌是以茶糖水为原料 由酵母菌 、醋酸菌和乳酸菌等多种细菌共生发酵而成 , 具有多种医疗保健功能 。本研究采用 K2B 纸片扩散 法进行药敏试验 ,观察不同酸碱度的红茶菌液及其蛋 白提取液的抑菌效果 。
3 材料和方法
1 菌种及培养基 红茶菌 、大肠埃希菌 (D H5α) 、金黄色葡 萄球菌
中国病原生物学 J ournal of Pathogen B
杂志 iolog y
2008
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年 12 月 第 3 mber 2008 , Vol
卷第 12 . 3 , No .
期 12
·论著 ·
红茶菌发酵液抑菌作用研究
张玉梅1 , 房卫刚2 , 李波清1 3 , 张珍1
(1. 滨州医学院烟台校区病原生物教研室 ,山东烟台 264003 ;2. 滨州医学院 2003 级生物技术专业本科学生 ,山东烟台 264003)
【摘要】 目的 研究不同 p H 值下红茶菌发酵液及其蛋白提取液的抗菌作用 ,为探寻新的抗菌物质奠定基础 。 方法 采用 K2B 纸片扩散法检测不同 p H 值下红茶菌发酵液及不同量的蛋白提取液分别对大肠埃希菌 、金黄色葡萄球菌和白 色念珠菌的抑菌作用 。 结果 红茶菌发酵液在酸性条件下对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的生长具有明显的抑制作 用 ,而在碱性条件下均未表现出抑制作用 ;红茶菌蛋白提取液对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌有抑菌活性 ,红茶菌发酵 液及蛋白提取液对白色念珠菌无明显抑菌作用 。 结论 红茶菌发酵液具有明显的抑制金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌 生长的作用 。红茶菌发酵产生的蛋白质类物质是红茶菌液中的抑菌活性成分之一 ,具有用作食品抑菌剂的潜在价值 。 【关键词】 红茶菌 ; 抑菌作用 ; 纸片扩散法 ; 抑菌蛋白 【中图分类号】 R378 【文献标识码】 A 【文章编号】 167325234 (2008) 1220890202
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月 第 3 2008 , Vol
卷第 12 . 3 , No .
期 12
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2 %的量接种红茶菌菌种 ,摇匀 ,用 6 层纱布封口 ,移入 30 ℃电热恒温箱中发酵 。分别取发酵 2 周和 3 周的 发酵液 ,过滤除去红茶菌膜和其他较大的杂质 ,然后 4 ℃4 000 r/ min (离心半径 30 cm) 离心 30 min ,上清液 用 0. 2μm 微孔滤膜过滤器过滤除菌 。取除菌后的发 酵液灌装于灭菌后的青霉素小瓶中 ,每瓶 3 ml ,分别 用 1 mol/ L 的 NaO H 和 HCl 调节酸碱度 ,得到 p H 值 为 1. 0 、4. 0 、7. 0 和 10. 0 的发酵液 。 5 红茶菌蛋白提取液制备
高速冷冻离心机 (BAC KMAN 公司) 、生物安全柜 (苏 净集团安泰公司) 及全自动高压灭菌器 ML S23780 (日 本 SAN YO 公司) 等 。 3 供试菌的复苏和浓度测定
划线接种法将菌种接种于平板 ,37 ℃培养 24 h ; 挑取单菌落接种于液体培养基 ,白色念珠菌 28 ℃,金 黄色葡萄球菌和大肠埃希菌 37 ℃摇床培养 16 h～18 h 。用分光光度计测定各菌液 A600 值 ,并用无菌培养基 调 A600 值为 0. 5 。 4 红茶菌发酵液的制备
[ J ournal of Pat hogen B iolog y . 2008 Dec ; 3 (12) : 890 - 891 ,902. ]
Bacteriostasis of black tea f ungus broth ZHAN G Yu2mei1 , FAN G Wei2gang2 , L I Bo2qing1 , ZHAN G Zhen1 (1. De partment of Pat hogenic organ2
ism , B i nz hou Medical Col lege , Yant ai 264003 , S han don g , Chi na; 2. Technolog y 2003 un der g ra d uate st u dent , B i nz hou Me dical Col le ge , Yant ai 264003 , S hsn don g , Chi na)
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
中国病原生物学 J ournal of Pathogen B
杂志 iolog y
2008 年 12
【Abstract】 Objective To explore t he antibacterial activity of black tea f ungus brot h and p rotein ext ract under different p H values and lay t he fo undation fo r t he new antibacterial substances. Methods KB disk diff usio n met hod was used in different p H values under t he black tea f ungus brot h and different amount s of p rotein ext ract , respectively Escherichi a co2 li , S t a p hy lococcus au reus and Can di d a albicans t he antimicrobial effect . Results Black tea f ungus brot h has apparent antibacterial activity against E. coli and S. aureus in acid environment and no antibacterial activity in alkaline enviro nment was fo und. Meanwhile t he p rotein ext ractio n of black tea f ungus has visible antibacterial activity to t hem. But bot h black tea f ungus brot h and it s p rotein ext ractio n has no antibacterial activity to C. albicans. Conclusion Black tea f ungus brot h has apparent antibacterial activity against E. coli and S . aureus. Protein2like substances p roduced f rom black tea f ungus is o ne of t he active ingredient s , and it has potential value as bacterial inhibitor on food vocatio n. 【Key words】 Black tea f ungus ; bacterio stasis ; Kribry2Bauer met hod ; inhibitory p rotein
选用上等红茶 ,按 1 %的量加入蒸馏水中 ,加热煮 沸 10 min ;按 8 %称取蔗糖 ,加入刚煮好的茶水中 ,搅 拌至完全溶解 ,过滤于锥形瓶中 ,冷却到 50 ℃以下 ;按
3 【通讯作者】 E2mail : sdliboqing @163. co m 【作者简介】 张玉梅 (1981 - ) ,女 ,硕士 ,助教 ,主要从事细菌分 子生物学的研究 。E2mail : meiyuzh @163. co m
结 果
1 不同 p H红茶菌发酵液对实验菌的抑菌作用 红茶菌液对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的抑菌
效果在 p H 1. 0～5. 0 范围内随着 p H 值降低而增强 ( P < 0. 01) ,p H5. 0 时抑菌环直径最小 ,为 (7. 52 ± 0. 025) mm ,p H1. 0 时抑菌环直径最大 , 为 ( 8. 71 ± 0. 095) mm ,抑菌效果见表 1 、2 。p H7. 0 和 10. 0 时的 红茶菌液对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌无抑菌作 用 ,不同 p H 的红茶菌液对白色念珠菌均无抑菌作用 。 2 不同量红茶菌蛋白提取液对实验菌的抑菌作用
采用三氯醋酸/ 丙酮沉淀法 。向盛有 1 ml 红茶菌 液的大离心管中缓慢加入 4 ml 冷的 50 %三氯醋酸 丙酮溶液 (三氯醋酸的提取浓度相当于 40 %) , - 20 ℃ 静止 1 h ,然后 4 ℃下 (离心半径 30 cm) 10 000 r/ min 离心 15 min ,弃上清液 。用丙酮乙醚 (1 ∶1) 混合液重 新悬浮沉淀物同法离心 15 min ,弃上清液 ,沉淀物风 干后用 p H7. 0 的磷酸盐缓冲液溶解 ,4 ℃保存备用 。 6 纸片扩散法检测红茶菌发酵液及蛋白提取液的抑 菌作用 6. 1 抑菌作用测定 将直径 6. 0 mm 的滤纸片灭菌 干燥后备用 ,取培养至对数期的细菌 ,分别取 A600 为 0. 5 的大肠埃希菌 、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌菌 液 0. 1 ml ,涂布直径为 90 mm 的培养基平板 ,再将药 敏纸片贴到平板上 ,白色念珠菌 28 ℃,金黄色葡萄球 菌和大肠埃希菌 37 ℃恒温箱培养 18 h ,按文献[ 3 ]的 方法测定抑菌环直径 。 6. 2 不同 p H 红茶菌发酵液抑菌实验 设置 p H 值 为 1. 0 、2. 0 、3. 0 、4. 0 、5. 0 、7. 0 和 10. 0 5 个不同 p H 平 板实验组 ,红茶菌液加样量均为 50μl ,每组重复 3 次 , 记录不同 p H 平板上的抑菌结果 。所得数据统计学处 理采用方差分析 。 6. 3 不同量蛋白提取液抑菌实验 以 p H7. 0 的 PBS 缓冲液为空白对照 ,以不同量的红茶菌蛋白提取液做 抑菌试验 ,每组重复 3 次 ,记录不同 p H 平板上的抑菌 结果 ,所得数据统计学处理采用方差分析 。
in different pH to St a p hylococcus a ureus
抑菌环直径 Diameters of the antibacterial ring (mm)
pH
抑来自百度文库环 1
抑菌环 2
抑菌环 3
Antibacterial ring 1 Antibacterial ring 2 Antibacterial ring 3
(A S 1. 1476) 和白色念珠菌 (2. 2411) 均由本研究室保 藏 。红茶菌培养基 :绿茶 、蔗糖和蒸馏水按 1 ∶8 ∶100 混合 ,煮沸 10 min 。实验菌培养基采用 LB 培养基[2] 和沙保弱培养基 。 2 实验仪器
电热恒温培养箱 (上海跃进公司) 、气浴恒温振荡 器 (山西荣华公司) 、p H 计 (北京海淀航天仪器公司) 、
空白对照组无抑菌环产生 ,不同量的红茶菌蛋白
提取液对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌具有明显的抑
菌作用 ,且抑菌作用随着用量增大而加强 ( P < 0. 01) 。
对白色念珠菌均无抑菌作用 。18 h 后观察红茶菌蛋
白提取液对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的抑菌效果
见表 3 、4 。
表 1 不同 pH的红茶菌液对金黄色葡萄球菌的抑菌作用 Table 1 Bacteriostasis of black tea f ungus broth
红茶菌又名海宝或胃宝 ,是我国民间广为流行的 一种传统酸性保健饮料[1] 。红茶菌是以茶糖水为原料 由酵母菌 、醋酸菌和乳酸菌等多种细菌共生发酵而成 , 具有多种医疗保健功能 。本研究采用 K2B 纸片扩散 法进行药敏试验 ,观察不同酸碱度的红茶菌液及其蛋 白提取液的抑菌效果 。
3 材料和方法
1 菌种及培养基 红茶菌 、大肠埃希菌 (D H5α) 、金黄色葡 萄球菌