学习细菌培养的基本技术

学习细菌培养的基本技术

1．实验目的

（1）了解配制培养基的一般步骤和方法。

（2）练习配制牛肉膏蛋白胨培养基。

（3）了解灭菌的基本原理，以及实验室中常用的灭菌方法。

（4）初步学会细菌培养的基本技术。

2．实验原理

根据细菌的需要配制培养基，在培养之前要彻底灭菌。根据某种细菌的营养需要而选择多种原料配制而成的培养基，不仅含有这种细菌生长繁殖所需要的各种营养物质，还要有适宜的pH、离子浓度。本实验所用的牛肉膏蛋白胨培养基，应用较广泛，适于芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等多种细菌的培养，配制好的培养基必须经过灭菌。灭菌是指杀死液体或固体表面所有微生物的细胞、芽孢和孢子。对不同的材料，应当采取不同的灭菌方法。培养基一般采用高压蒸气灭菌法，就是将待灭菌的培养基放入密闭的高压蒸气灭菌锅内，通过加热使锅内的水沸腾并产生水蒸气。当水蒸气将锅内的冷空气排尽以后，关闭排气阀并继续加热，这时锅内的压力就会升高，最终使菌体蛋白质凝固变性，从而达到灭菌的目的。接种环是用火焰烧灼灭菌的。无菌室或超净工作台则是通过紫外线照射灭菌的。

将某种细菌接种在彻底灭菌的培养基上，经过一段时间的培养后，就能够得到生长良好的细菌群体，它们在培养基上会呈现出一定的形态特征。

3．实验材料

天平、角匙、200 mL烧杯、试管、漏斗、量筒、玻棒、滴管、胶管、弹簧夹、铁架台、酒精灯、石棉网、三角架、火柴、纱布、棉花、牛皮纸、线绳、标签、接种环、pH试纸、金属小筐、高压蒸汽灭菌锅、无菌操作箱。芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、NaCl、浓度为1 mol/L 的NaOH溶液、体积分数为75%的酒精溶液、蒸镏水。

4．实验方法与步骤（1）培养基的配制

细菌培养的基础是配制培养基牛肉膏蛋白胨培养基的配方然后再加热溶解，补足水分，其制作过程包括以下几个环节：

①清洁玻璃器皿一般用肥皂液煮沸30 min,或用重铬酸钾和浓硫酸配制的溶液浸泡数

10 min，然后用清水冲洗，晾干后保存备用。

②配制液体培养基a．根据需要配制培养基数量，先在烧杯中注入少量蒸馏水；b．按培养基配方称量各种成分的原料，依次使之溶解；c．补足需水量；d．如用牛肉膏、蛋白胨配制时，需加热熔化后溶解；e．加热后，补足水分即可。

③配制固体培养基在液体培养基里加入一定量的琼脂，加热熔化即可。

④调pH 先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基滴加1 mol/L 的NaOH溶液，边加边搅拌，并随时用pH试纸测pH,直到7.4～7.6为止。反之则用1 mol/L的HCl进行调节。

⑤过滤分装用纱布趁热过滤，将滤液分装于试管中，其量约为试管体积的1/5（不要玷污管壁）。

⑥加棉塞培养基分装完毕以后，在管口上加一个棉塞。棉塞能防止杂菌污染；保证通气良好，加棉塞时，应使棉塞长度的2/3在试管口内。

⑦包扎每10支试管用线绳捆成一捆，并且在管口外面包上一层牛皮纸，然后用线绳扎好。在每捆试管外挂上标签，注明培养基名称、配制日期和制作者姓名。

（2）灭菌高压蒸汽灭菌的效果是细菌培养的关键。具体操作如下：

①打开高压灭菌锅，取出里面的灭菌桶，向锅内加水（最好用开水）水面与底架平齐为宜。

②将扎好的试管管口向上，竖放在灭菌桶内，再将灭菌桶放回灭菌锅。

注意：灭菌桶内的物品不能放得太挤，否则会影响灭菌效果。

③加盖，并将排气软管插入灭菌桶的排气槽内。以两两对称的方式，同时旋紧相对的两个紧固螺栓，以防漏气。

④排出锅内的冷空气。打开火源，当压力上升到49 kPa时，打开排气阀放气，当压力

回到0时，关闭排气阀。重复上述放气过程一次，以彻底排出锅内的冷空气。

⑤当锅内的压力上升到98 kPa时，控制火力大小，使压力维持在98 kPa左右20 min，切断电源。

⑥当压力降至0以后，打开排气阀，完全排出水蒸气（约10 min）后，放松紧固螺栓，取出试管。最后，将灭菌锅里的水排放干净。

（3）搁置斜面

灭菌后的培养基冷却到50℃时，将每个试管带棉塞的一端搁在一根木棒上，使培养基形成斜面，斜面的长度不超过试管总长度的一半。

（4）接种

①用肥皂将双手洗净，擦干，再用酒精棉球（体积分数75%）擦拭双手。

②当手上酒精挥发后，点燃酒精灯。

③接种，操作程序见下图。

a．用左手大姆指、食指和无名指夹住菌种试管和待接种的斜面试管，管口并齐，并使斜面向上成水平状态。右手拧松棉塞，但不要取下。

b．右手拿接种环（如握钢笔），在火焰上烧灼灭菌。注意：有可能伸入试管内的接种环其余部分也要烧灼，特别是箍处。

c．在火焰边用右手无名指和小指夹住两个棉塞，将它们取下（不能放下）同时左腕转动烧灼管口一周，勿烧得过烫。

d．将接种环伸入菌种试管内，让环先接触培养基上未长菌的部位，使环冷却。轻轻挑取少量菌体，立即将接种环抽出。

e．在火焰旁迅速将沾有菌体的接种环伸到斜面培养基的底部，由里向外轻轻划蛇形细线，线要划密一些。注意不要将培养基划破，也不要使接种环接触到管壁或管口。f．抽出接种环，再用火焰烧灼管口，并在火焰上方将棉塞塞上。将接种环在火焰上烧红灭菌，接种致病菌时更要注意这点，将棉塞旋紧。

④熄灭酒精灯。在接种试管标签上填写菌种、日期、接种者。实验后的带菌培养基处理掉，如果生长有非致病菌，加热后倒掉。生有致病菌的，必须高压蒸气灭菌后倒掉。（5）培养

将接种后的试管放入恒温箱内，在25℃下培养5～7d，或在37℃下培养1d。

（6）观察记录

当培养基表面长出菌落后，观察各种菌菌落的大小、形态、质地、颜色，并作记录。5．注意事项

（1）培养基分装完毕。管口通常用棉塞封住。制作棉塞时，不要使用脱脂棉，因为脱脂棉容易吸水。

（2）灭菌结束后，切勿过早打开排气阀，否则，开盖时试管内的培养基会由于内外压力不平衡而冲出管口，使棉塞沾染培养基而发生污染。

（3）接种划线时要注意：a．划线的方向应该从里往外；b．线条要细且密；c．不要重复划线