流式细胞术实验技巧及数据分析讲解
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流式细胞术实验技巧及数据分析
上海交通大学医学院 史桂英
BD公司不同型号流式细胞仪
FACSCalibur
FACSCanto
FACSCount
LSRII
FACSAria
FACSVantage&DiVa
一 流式细胞仪的基本原理
*稳定流动 *激发光斑 *荧光补偿 *荧光素选择
二 数据分析及开窗
FCM原理示意图
525、575、675 绿、橙红色、红色
525 、 575 绿色、橙色
670
红色
能量传递染料：
用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一 起，在488nm波长激发光激发后产生的发射波长 激发另一荧光染料产生的荧光信号。
Laser
488nm
ECD 620
PE CY5 670
CY7 755
流式细胞术操作流程：
荧 光
Uncompensated vs Compensated
补
偿
FL2
FL1
利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻
荧光通道的信号加以扣除的方法称“荧光补偿”
wk.baidu.com
荧光补偿
Mean值判断补偿
双或多参数荧光抗体的组合标记
荧光染料
激发波长（nm) 发射波长（nm)
颜色
FITC+PE
488
FITC+T red
时可以了解不同细胞的DNA合成能力高低。
BrdUrd与PI检测
BrdUrd与PI检测
BrdUrd与PI检测
细 胞 三 色 荧 光 检 测
细胞因子测定
*检测T细胞(CD69)活化
G6=R1*R5
*CD4抗原分子结构引起CD4荧光强度下调
细胞因子分析图
*过敏性鼻息肉与鼻息肉细胞因子比较
层流技术
层流是液体稳定流动的必要条件,管道中层流 的形成要满足雷诺数
dρV Re = < 2300，
η 式中ρ、η分别为液体的密度和粘滞系数，d 和V分别为管道的直径和液体的平均流速。FCM 利用层流技术,使细胞流动稳定,并具有自聚焦 作用,为细胞分析分选提供技术保证.
液流驱动系统（示意图）
流速与压力的关系服从Bernoulli方程，即 P=(1/2)V2 (忽略高度的变化)。改变气压,就可获得不同的流速。
纯化单核细胞
调节性T细胞检测
G3=R1*R3 G4=R1*R4
凋亡细胞测定
凋亡细胞测定
细胞凋亡检测
阴性的设置
血 小 板 检 测
血 小 板 检 测
血 小 板 检 测
血小板检测
谢谢
培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋
单细胞悬液 制备
荧光抗体标记
上机检测
表型测定 细胞分选
统 计 学 分 析
FISH PCR
继 续 培 养
单 分 散 细 胞
FSC
FSC信号的强弱与细胞的大小和活力相关
SSC
SSC信号的强弱与细胞内颗粒多少相关
细胞散色光信号
细胞荧光测量
细胞的自发荧光 未经染色的样品细胞
BrdUrd和DNA双标记染色
溴脱氧尿嘧啶核苷( Bromodeoxyuridine， BrdUrd )是胸苷的一种类似物。它可以替代
胸腺嘧啶掺入到细胞新合成的DNA分子中，成为S 期细胞的一种标记物。流式细胞术采用抗BrdUrd 单克隆抗体免疫荧光和PI双参数检测细胞，不仅 可检测一个细胞群体的动力学参数和DNA含量，同
在激发光的照射下可测到有微弱的荧 光信号.
细胞的特异性荧光 经过各种特异染色的
细胞在激发光的照射下可测到较强的荧光 信号.
自发荧光信号与特异染色的荧光信号分析图 自 发 荧 光 信 号
特 异 染 色 的 荧 光 信 号
DNA分析比较
排除双联体细胞
细胞阻滞在G2M期
双 克 隆 细 胞 周 期 分 析
488
568
FITC+PeCy5 488
FITC+ ECD
488
F+P +PeCy5
488
F+ ECD +PeCy5 488
F+P +PeCy5 +APC 488
633
525 、575
绿色、橙色
525
绿色
615
红色
525、 675
绿色、 红色
525、 625
绿色、橙红色
525、575、675
绿、橙、红色
低速
高速
不同样本速率形成的样本流
激发光源与光束成形系统
光
束
聚焦距离
成
形
与 激光束
.
细
聚焦透镜
胞
这种椭圆形 20um 光斑的检测
受
区保证每个
照
64um
细胞分别受
方 式
强度
到光照且受 检时受到一 致的光照
FCM的单细
32um 0 32um
胞照明技术
荧 光 光 谱 重 叠
FITC和PE荧光光谱重叠
上海交通大学医学院 史桂英
BD公司不同型号流式细胞仪
FACSCalibur
FACSCanto
FACSCount
LSRII
FACSAria
FACSVantage&DiVa
一 流式细胞仪的基本原理
*稳定流动 *激发光斑 *荧光补偿 *荧光素选择
二 数据分析及开窗
FCM原理示意图
525、575、675 绿、橙红色、红色
525 、 575 绿色、橙色
670
红色
能量传递染料：
用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一 起，在488nm波长激发光激发后产生的发射波长 激发另一荧光染料产生的荧光信号。
Laser
488nm
ECD 620
PE CY5 670
CY7 755
流式细胞术操作流程：
荧 光
Uncompensated vs Compensated
补
偿
FL2
FL1
利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻
荧光通道的信号加以扣除的方法称“荧光补偿”
wk.baidu.com
荧光补偿
Mean值判断补偿
双或多参数荧光抗体的组合标记
荧光染料
激发波长（nm) 发射波长（nm)
颜色
FITC+PE
488
FITC+T red
时可以了解不同细胞的DNA合成能力高低。
BrdUrd与PI检测
BrdUrd与PI检测
BrdUrd与PI检测
细 胞 三 色 荧 光 检 测
细胞因子测定
*检测T细胞(CD69)活化
G6=R1*R5
*CD4抗原分子结构引起CD4荧光强度下调
细胞因子分析图
*过敏性鼻息肉与鼻息肉细胞因子比较
层流技术
层流是液体稳定流动的必要条件,管道中层流 的形成要满足雷诺数
dρV Re = < 2300，
η 式中ρ、η分别为液体的密度和粘滞系数，d 和V分别为管道的直径和液体的平均流速。FCM 利用层流技术,使细胞流动稳定,并具有自聚焦 作用,为细胞分析分选提供技术保证.
液流驱动系统（示意图）
流速与压力的关系服从Bernoulli方程，即 P=(1/2)V2 (忽略高度的变化)。改变气压,就可获得不同的流速。
纯化单核细胞
调节性T细胞检测
G3=R1*R3 G4=R1*R4
凋亡细胞测定
凋亡细胞测定
细胞凋亡检测
阴性的设置
血 小 板 检 测
血 小 板 检 测
血 小 板 检 测
血小板检测
谢谢
培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋
单细胞悬液 制备
荧光抗体标记
上机检测
表型测定 细胞分选
统 计 学 分 析
FISH PCR
继 续 培 养
单 分 散 细 胞
FSC
FSC信号的强弱与细胞的大小和活力相关
SSC
SSC信号的强弱与细胞内颗粒多少相关
细胞散色光信号
细胞荧光测量
细胞的自发荧光 未经染色的样品细胞
BrdUrd和DNA双标记染色
溴脱氧尿嘧啶核苷( Bromodeoxyuridine， BrdUrd )是胸苷的一种类似物。它可以替代
胸腺嘧啶掺入到细胞新合成的DNA分子中，成为S 期细胞的一种标记物。流式细胞术采用抗BrdUrd 单克隆抗体免疫荧光和PI双参数检测细胞，不仅 可检测一个细胞群体的动力学参数和DNA含量，同
在激发光的照射下可测到有微弱的荧 光信号.
细胞的特异性荧光 经过各种特异染色的
细胞在激发光的照射下可测到较强的荧光 信号.
自发荧光信号与特异染色的荧光信号分析图 自 发 荧 光 信 号
特 异 染 色 的 荧 光 信 号
DNA分析比较
排除双联体细胞
细胞阻滞在G2M期
双 克 隆 细 胞 周 期 分 析
488
568
FITC+PeCy5 488
FITC+ ECD
488
F+P +PeCy5
488
F+ ECD +PeCy5 488
F+P +PeCy5 +APC 488
633
525 、575
绿色、橙色
525
绿色
615
红色
525、 675
绿色、 红色
525、 625
绿色、橙红色
525、575、675
绿、橙、红色
低速
高速
不同样本速率形成的样本流
激发光源与光束成形系统
光
束
聚焦距离
成
形
与 激光束
.
细
聚焦透镜
胞
这种椭圆形 20um 光斑的检测
受
区保证每个
照
64um
细胞分别受
方 式
强度
到光照且受 检时受到一 致的光照
FCM的单细
32um 0 32um
胞照明技术
荧 光 光 谱 重 叠
FITC和PE荧光光谱重叠