高效液相色谱法

输液泵种类------恒压型和恒流型。 • 恒压泵：(类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的匀浆填 充。但因泵腔体积大，在往复推动时会引起脉动， 且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变 化而变化，现已较少使用。 • 恒流型：溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。 有机械注射式和机械往复式两种。应用最多的是机 械往复式恒流泵(每分钟往复25-100次，因此脉动 小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此 时可连接一脉冲阻尼器)。
He
出口检查
高压泵
脉流消除
储液瓶
入口检查
分布器 过滤 2μm
抽气
到检测器
分离柱
压力计
反压调节
过滤器
注样阀
HPLC仪器详解
9.2.1 高Βιβλιοθήκη Baidu输液系统
（1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器，其孔隙约 2 μm，可防止颗粒物进入泵内。 （2）脱气：超声波脱气或真空脱气机脱气。溶剂通过脱气 机中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中 除去。 （3）高压泵： 对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、 可调范围宽、耐腐蚀。
接参比电极 和对电极 接色谱柱
塑料块
Teflon
1 cm
工作电极 (Pt, Au, 碳糊)
采用安培检测器时，流动相必须含有电解质，且呈化学 隋性。它最适于与反相色谱匹配。但此检测器只能检测具有 电活性（能氧化、还原）的物质。 b. 电导检测器 电导检测器主要用于离子色谱的检测。 其原理是基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导 （电阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。 电导检测器的主要部件是电导池。其响应受温度影响较 大，因此需要将电导池置于恒温箱中。另外，当 pH>7 时，该检测器不够灵敏。 • HPLC的检测器还有MS、IR等。
（4）蒸发光散射检测器(evaporative light scattering detector，ELSD) 是一种通用型质量检测器，检测限一般为8～10ng，可用 于挥发性低于流动相的任何样品组分，特别适用于无紫外 吸收的样品。主要用于糖类、高 级脂肪酸、磷脂、维生素、 甾类等化合物测定。可作为 HPLC和超临界色谱（SFC） 的检测器，发展迅速。
9.2.2 进样系统
与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所产生 的峰形展宽相对要小些。即HPLC的展宽多因一些柱外因素 引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及检测器的死 体积。进样装置包括两种。 （1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死 体积小。但进样量小且重现性差。 （2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可 由定量环控制，因此进样准确，重复性好。（P367）
极性增加 不溶于水 非极性 非离子极性 分配 吸附 反向分配 正向分配 离子交换 溶于水 离子
尺寸排阻 凝胶渗透
凝胶过滤
各种HPLC方法的应用范围及对象
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9.2 高效液相色谱仪
包括： 高压输液装置 进样系统 分离系统 检测系统 此外还配有脱气、 梯度洗脱、恒温、自 动进样、馏分收集和 数据处理装置等辅助 系统。 HPLC工作过程
装入样品 采样环 进样
进色谱柱 泵入溶剂 出口
9.2.3 色谱柱
（1）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头 的死体积尽可能小。柱长多为15～30cm，内径为4～ 5mm(尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱柱内径更 大)； （2）柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的 性质不同可分为： • 平衡密度法：即使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时 颗粒沉降速度趋于0。常用的匀浆试剂有四氯乙烯、四溴 乙烷和二碘甲烷等； • 非 平 衡 密 度 法 ： 当 采 用 粘 度 较 大 的 试 剂 ， 如 CCl4 ， CH3OH，丙酮，二氧杂环已烷、THF等。
9.3.2 固定相载体
由于各种HPLC分离方法的流动相均为液体，因此， HPLC通常是按照固定相载体或固定液的不同来分类的。 1. 按承受压力分 • 刚性固体：SiO2为基质，耐压为7.0×108～1.0×109 Pa。 可制成直径、形状和孔隙深度不同的颗粒；主要用于吸 附、分配和键合色谱； • 硬胶：以聚合物为基质(常用苯乙烯与二乙烯苯交联而 成)，耐压上限为3.5×108 Pa, 主要用于离子交换和尺寸排 阻色谱。
接色谱柱
石英窗
UV
光电倍增管
废液
在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透 过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长。
紫外吸收检测器类型： a. 固定波长紫外吸收检测器：低压汞灯提供固定254nm或 280nm紫外光。 b. 可变多波长检测器(VWD)：氘灯做光源，光栅分光 c. 光二极管阵列检测器 photo－diode array detector （DAD，PDAD，PDA）：钨灯和氘灯组合光源，进入 检测池的不是单色光，而是一段紫外波长上的光。可 以辅助定性。
9.4 HPLC方法各论
9.5 HPLC的分析和应用 9.6 制备液相色谱 9.7 毛细管电泳 9.8 超高效液相色谱 9.9 高速逆流色谱 9.10 超临界流体色谱
9.5.1 定性分析 9.5.2 定量分析 9.5.3 应用
Agilent 1100
美国MILLI-Q Elix5 超纯水器
9.1 概述
9.1.2 HPLC与GC的比较
分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化 合物，而这些物质只约占有机物总数的20%；HPLC可以 分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质 占有机物总数的80%。 流动相的选择：GC采用的流动相中为数有限的几种“惰性” 气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动 相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了 起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作 用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来 控制和改进分离。 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
高速：HPLC采用高压输液设备，流速大大增加，分析速度极 快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分 析需时数小时。 高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力 小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质 的分离。 高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g, 荧光检测器— —10-11g。
到色谱柱 脉冲阻 尼器 球阀 往复式拉动
密封 马达
溶剂
机械往复柱塞泵示意图
（4）梯度洗脱装置：在分离过程中逐渐改变流动相组成的 装置。如果只有一个泵（四元泵），可采用低压混合设计 （将两种或以上的溶剂按一定比例混合，再由高压泵输 出）；如果有两个或以上泵（二元泵），调节各自的流 量，在高压下混合。
2. 按孔隙深度分 • 表面多孔型：以实心玻璃珠为基体，在基体表面覆盖一 层多孔活性材料(如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子 筛、聚酰胺等)。表面多孔型固定相的颗粒大(易装柱)、 多孔层厚度小且孔浅(渗透性好，出峰快)；但交换容量 小。适于常规分离分析。 • 全多孔型：全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成，因颗粒 极细，因而孔径小、传质快、柱效高。特别适于复杂混 合物的分离。 3. 按分离原理分 分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和 亲和色谱法等固定相。
填充方法： 填充时，按上述方法制作匀浆液，用流动相充满色谱柱 及其延长管中，然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压 力下迅速将其注入色谱柱内。要求填充速度快(防凝聚、沉 降或结块)、且无空气进入(影响填充均匀性)。 各种色谱柱
9.2.4 检测器
液相色谱检测器包括紫外光度、 荧光、示差折光和安培检测器等。 （1）紫外光度检测器(ultraviolet photometric detector) 其检测原理和UV-Vis方法一样。 只是，此时所采用的吸收池为微量 吸收池，通常其光程为2～10mm, 体积约为1～10μL。 HPLC分析中，约有80%的物质 可以在254nm或280nm处产生紫外 吸收。因此该类检测器应用很广。
高效液相色谱法(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱 方法。 按照分离机制不同可分为：液固吸附色谱法；液液分 配色谱法；离子交换色谱法；离子对色谱法；离子色谱 法；空间（尺寸）排阻色谱法(凝胶过滤、渗透色谱法)。此 外，还有亲和色谱法等。 早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1～ 5cm，长50～500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱 流速，填充的固定相颗粒直径多在150～200μm范围内。即 使这样，流速仍然很低(<1mL/min)，分析时间仍然很长！ 当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减 少，但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。
ELSD原理图
（5）电化学检测器(electrochemical detector, ECD) 包括：安培、电导、库仑、介电常数、极谱检测器等 a. 安培检测器 由恒电位仪和一薄 层反应池（体积为1～ 5μL）组成。如图。 该检测器是利用待测 物流入反应池时在工作 电极表面发生氧化或还 原反应，两电极间就有 电流通过，此电流大小 与待测物浓度成正比。
平面镜 样品 透镜 遮光板 光源
放大器 光电转换 参比 光学零 调零 记录仪
原理：利用两束相同角度的光照射流动相和样品+流动 相，利用二者对光的折射率不同，其中一束光（通常是通 过样品+流动相）因为发生偏转造成两束光的强度差发生 变化，将此差示信号放大并记录，该信号代表样品的浓度。 为通用型检测器，灵敏度为10-7g/mL。但对温度变化 敏感，且不适于梯度洗脱。
为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为有效地 增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（1.5～10μm）！ 直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相 以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱 效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。
9.1.1 HPLC与LC的比较
9.1.3 应用
由于HPLC分离分析 的高灵敏度、定量的准确 性、适于非挥发性和热不 稳定组分的分析，因此， 在工业、科学研究，尤其 是在生物学和医学等方面 分 子 应用极为广泛。如氨基酸、量 蛋白质、核酸、烃、碳水 化合物、药品、多糖、高 聚物、农药、抗生素、胆 固醇、金属有机物等分 析，大多是通过HPLC来 完成的。
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9.3 HPLC流动相和固定相简介
9.3.1 流动相
与GC流动相不同，HPLC流动相为溶剂，它既有运载作用， 又和固定相一样，参于对组分的竞争，因此溶剂的选择对分 离十分重要。 理想的溶剂应有下列特性： （1）对待测物具一定极性和选择性； （2）使用UV检测器时，溶剂截止波长要小于测量波长(为什 么？)；使用RID检测器时，溶剂的折光率要与待测物的 折光率有较大差别； （3）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长 增加； （4）化学稳定性好； （5）适宜的粘度。粘度过高，柱压增加；过低，易产生气泡。
皮质酮 氟美松 可的松
波长
快速扫描—光电二极管阵列（DAD）检测所获得的三维色谱-光谱图
（2）荧光检测器(fluorescence detector，FD) 许多有机物具有荧光活性，尤其是芳香族化合物具有 很强的活性。荧光检测器是一种选择性很强的检测器，其 灵敏度比UV检测器高2～3个数量级。
（3）示差折光检测器(differential refractive index detector, RID)
9
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography，HPLC
9.1.1 HPLC与LC的比较 9.1 概述 9.1.2 HPLC与GC的比较 9.1.3 应用 9.2.1 高压输液系统 9.2 高效液相色谱仪 9.2.2 进样系统 9.2.3 色谱柱 9.2.4 检测器 9.3.1 流动相 9.3 HPLC流动相和固定相简介 9.3.2 固定相载体 9.4.1 液液分配色谱法 9.4.2 离子交换色谱法 9.4.3 离子色谱法 9.4.4 离子对色谱法 9.4.5 空间排阻色谱法 9.4.6 亲和色谱法 9.4.7 色谱分离方法的选择