动物早期性别控制的方法

第６卷第１期２００８年３月

延安大学学报（医学科学版）

ＪｏｕｒｎａｌｏｆＹａｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＭｅｄＳｃｉ）

Ｖ０１．６Ｎｏ．１

Ｍａｒ．２００８动物早期性别控制的方法

张晓文，惠清法，孙志宏

（延安大学生命科学学院，陕西延安７１６０００）

性别控制是通过人为干预使雌性成年动物按照人们的意愿生产特定性别后代的动物繁殖新技术，通过它可以提高畜牧业的经济效益，消灭不理想的隐性性别以及防止性连锁疾病，加快珍稀动物的繁殖、保种进程，促进遗传科学的发展。因此，此项技术的实践价值是非常高的。本文主要就近几年性别控制的方法及其优缺点作一综述。

性别控制主要是从两方面实现的，一是ｘ与Ｙ精子的分离，二是胚胎性别鉴定。

１Ｘ与Ｙ精子的分离

精母细胞通过减数分裂后形成了ｘ和Ｙ两类精子，Ｘ精子与卵子结合形成雌性胚胎，Ｙ精子与卵子结合形成雄性胚胎。如若能够对两类精子在受精前进行分选，便可得到理想性别的子代，可谓是既快速又经济的方法。早期对于ｘ、Ｙ精子分离主要采用物理分离法…，如沉降法、离心沉降法和电泳法。这三种方法依据ｘ、Ｙ精子间的物理性差异进行分离，因而结果不稳定，可靠性差，且效率低，所以现在很少应用。目前研究较多的方法有以下两种：

１．１免疫学分离法

原理是Ｙ精子上存在雄性特异性组织相容性抗原（Ｈ—Ｙ抗原），可利用Ｈ—Ｙ抗体检测精子质膜上是否存在Ｈ．Ｙ抗原来分离ｘ精子（Ｈ．Ｙ抗原阴性）和Ｙ精子（Ｈ—Ｙ抗原阳性）口Ｊ。主要有免疫亲和柱层析法和免疫磁力法¨ｏ。１９９２年，美国科学家用免疫磁力法成功、高效分离出ｘ精子与Ｙ精子，有人预测可能是快速，低成本的理想方法一。。据报道，精液经Ｈ—Ｙ抗原血清处理后进行人工授精，７４％牛犊为雌性”Ｊ。王光亚等∽’用兔Ｈ—Ｙ抗血清进行试验，将效价为１：３２的兔Ｈ—Ｙ抗血清输入发情母兔阴道内１０—１５ｍｉｎ后自然交配，所生两只小兔均为雌兔。但随着对Ｈ－Ｙ抗原研究的深入及检测技术的改进，人们发现Ｈ—Ｙ抗原并非只存在于Ｙ精子。有研究表明Ｘ和Ｙ精子与Ｈ－Ｙ抗原的结合无显著差异。所以当前此分离精子的方法也面Ｉ临着严峻挑战。

１．２流式细胞分离法

原理是根据ｘ精子和Ｙ精子中ＤＮＡ含量的差异进行精子性别鉴定。不同的物种中ｘ精子ＤＮＡ含量高于Ｙ精子中ＤＮＡ含量２．８％～７．５％（Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９９６），用流式细胞分离器可以把两类精子分开。具体方法是：先用ＤＮＡ特异性染料对精子活体（经过精液稀释后）染色，染料可渗人精细胞膜使ＤＮＡ着色，着色量与ＤＮＡ量成正比，ｘ精子发出的荧光强于Ｙ精子。然后使精子连同少量稀释液逐个通过激光束，探测器根据精子的发光强度把电信号传递给计算机，计算机指令液滴充电器使发光强度不同的液滴带不同的电荷，然后通过高压电场，不同电荷的液滴在电场中被分离０７ｊ。１９８９年Ｊｏｈｎｓｏｎ等首先报道用流动细胞分类仪成功分离兔ｘ、Ｙ精子，并用分离精子受精产下后代。此后，人类利用此方法已成功地分离了小鼠、兔、牛、羊和猪等动物的精子，并在不同动物种间取得了７０％一９０％的分离效果¨Ｊ。它是当前精子分离方法中最新的也是分离纯度较高的一种方法。

２胚胎性别鉴定

２．１细胞遗传学方法

即核型分析法。其基本原理是在胚胎滋养层上取一部分细胞，先用秋水仙素处理，再固定染色，检查性染色体，根据染色体中期的谱带差异、Ｙ染色体的大小及形态判断性别，准确率达１００％归Ｊ。该方法准确率高，却阻断了有丝分裂，要求操作人员经验丰富，且采集细胞对胚胎有伤害，不适合在生产实践中应用，主要用来验证其他性别鉴定方法的准确率。

２．２生物化学微量分析法

通过测定与Ｘ染色体相关的酶活性，来达到鉴别胚胎性别的目的。早期雌性胚胎的两条Ｘ染色体中有一条失活，在胚胎基因组的激活与ｘ染色体失活之间的短暂时期内，雌性的两条ｘ染色体都可转译，雌性胚胎中与ｘ染色体相关酶的浓度及活性是雄性胚胎的两倍。这些酶包括６一磷酸葡萄糖脱氢酶、次黄嘌呤核酸转移酶、腺嘌呤磷酸转移酶、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶。据此将ｘ一联结酶的底物、辅酶和提示剂与早期胚胎一期孵育，记录各胚胎着色的深浅并进行分类，从而鉴定胚胎的性别¨…。该方法的缺点是指示剂潜在细胞毒性会降低胚胎存活方，且ｘ染色体的失活确切时间不清楚，易发生误判。

２．３免疫学方法

原理是利用Ｈ－Ｙ抗血清或Ｈ－Ｙ单克隆抗体检测胚胎上是否存在雄性特异性Ｈ—Ｙ抗原，从而鉴定出胚胎性别。主要包括以下三种方法：

２．３．１细胞毒性分析法将Ｈ—Ｙ抗血清与补体（鼠血清）加入培养液中对胚胎进行培养，表达Ｈ—Ｙ抗原的雄性胚胎有一定程度的细胞裂解或发育受阻，不能形成正常的囊胚，此类胚胎判为雄性，相反则被判为雌性…Ｊ。此方法缺点是以

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毁掉雄胚为代价，且准确率不高，并降低了胚胎的成活率¨…。因而现在已经很少采用。

２．３．２间接免疫荧光法将胚胎在含有Ｈ—Ｙ抗血清或单克隆抗体的培养液中培养，然后再加入异硫氰酸盐荧光素标记的第二抗体，在荧光显微镜下观察是否呈现特异荧光，有荧光者为雄胚，无荧光者为雌胚”ｏ。１９９６年，ＺｈｕＹｕｄｉｎｇ【１４３等用Ｈ．Ｙ单克隆抗体通过间接免疫荧光法鉴定了小鼠胚胎的性别，经ＰＣＲ验证表明，荧光胚胎６７．３ｌ％为雄性，８２．２２％无荧光胚胎为雌性。此方法的特点是不损害胚胎，但对荧光强弱的估价主观性较强，Ｈ—Ｙ抗体特异性不高，准确率较低¨“。

２．３．３囊胚形成抑制法将Ｈ．Ｙ抗血清与桑椹胚共同培养一段时间，雄性胚胎则被Ｈ．Ｙ抗体所抑制，不能形成囊胚腔，而无Ｈ．Ｙ抗原的雌性胚胎则不被Ｈ－Ｙ抗体所抑制，可发育形成囊胚，从而将雌、雄胚分开。１９８９年，内海恭三将大鼠Ｈ．Ｙ抗体与大鼠桑椹胚共同培养６小时，形成囊胚者为雌性胚，未形成囊胚者为雄性胚，这类雄性胚除去Ｈ—Ｙ抗体后数小时还可形成囊胚。将这两种胚胎移植后分别获得了７９．１％的雌鼠和９１．３％的雄鼠。Ｉ”１经此方法鉴定的胚胎移植后与正常胚胎没有差别，因而比较实用。缺点是容易将一部分发育迟缓的雌胚误判为雄胚¨“。

２．４分子生物学方法

２．４．１ＤＮＡ探针法以从Ｙ染色体上分离出的特异性片断作为探针，将其标记后对检测的胚胎进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，阳性结果为雄性，阴性结果为雌性。Ｌｅｏｎａｒｄ等首次报道了用牛Ｙ染色体特异性ＤＮＡ探针法鉴定牛胚胎性别，准确率达９５％。１９８９年，美国格林纳达遗传公司用制备的３个雄性特异性探针鉴定牛胚胎性别，准确率高达９７～９９％。由于每种动物都必须有其特异性探针，过程较繁杂、耗费时间较长，应用上受到一定限制‘１…。

２．４．２ＰＣＲ扩增法即利用基因体外扩增技术检测ＳＲＹ基因（Ｙ染色体性别决定区基因）的有无。ＰＣＲ扩增和电泳时出现异常带的为雄性，反之为雌性０１９］。Ｈｅｒｒ等首先成功应用ＰＣＲ技术鉴定牛羊胚胎性别，准确率分别达９１．６％和９６．５％［驯。１９９５年，Ｐｏｍｔ实验室‘２¨根据猪、绵羊、山羊和牛的ＳＲＹ基因同源性设计引物，用ＰＣＲ扩增ＳＲＹ基因上１６３ｂｐ的区域，扩增是在ＳＲＹ／ＺＦＸ－－ＺＦＹＰＣＲ双扩增体系中进行，可以鉴定牛、绵羊、山羊等家畜和人的性别。国内，１９９１年，曾溢涛等旧２１应用ＰＣＲ技术扩增ＳＲＹ序列进行牛胚胎性别鉴定获得成功，准确率１００％。１９９８年，吕碧文等旧驯在利用ＰＣＲ技术扩增牛外周血淋巴细胞ＤＮＡ中的ＳＲＹ基因片段的基础上，早期胚胎ＰＣＲ性别鉴定率达８４．１％。陈从英等Ⅲ１利用此技术鉴定牛胚胎性别，结果达到１００％。目前采用多重ＰＣＲ进行胚胎性别鉴定，准确率高达９５％，仅需两小时就可完成。此法灵敏度高，速度快，可重复性好。最大问题是污染问题，操作中应严格注意瞄１。

２．４．３荧光原位杂交法（ＦＩＳＨ）荧光原位杂交法（ＦＩＳＨ）】０采用荧光标记的性染色体ＤＮＡ特异探针与组织取得到的胚胎细胞进行原位杂交以确定胚胎的性别。操作步骤包括荧光素探针制备、探针和靶ＤＮＡ的变性与杂交、观察鉴定三部分ｍｏ。ＫａｗａｒａｓａｋｉＴ等悼刊用ＦＩＳＨ技术以染色体Ｙ．探针和切割胚胎进行杂交检测猪胚胎性别，可鉴定率为９ｌ％（８５／９７），而９２％（６０／６５）的切割胚胎体外发育４８小时后有明显的囊胚腔和内细胞团，在接受移植的１２头受体中铲除１２头与鉴定结果一致的仔猪。Ｓａｎｔｉａｑｏｍｕｎｎｅ等旧１用绿色荧光索标记Ｙ染色体特异序列探针，红色荧光素标记Ｘ染色体重复序列探针，对处于４天前８细胞期的人胚胎进行了共６８个分裂球双探针ＦＩＳＨ检测，仅使用６小时就完成了从显微操作到显微观察的整个过程，准确检测了胚胎性别，其有效率达９５．５％（６５／６８）。杂交既能在分裂间期进行，也能在分裂中期进行，应用性广泛，同时具有高效快速和错误率低的优点。缺点是使用放射性物质对胚胎具有一定毒性。２．４．４ＬＡＭＰ法（ＩＪ００ｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）

是一种新式恒温核酸扩增方法，简便、快速、准确、廉价，它可以取代ＰＣＲ法。特点是对目标基因的６个区段设定４种引物，利用链置换反应在等温条件下使其发生反应。只要把基因检样、引物、链置换型ＤＮＡ聚合酶、基质等放在一定温度条件（６３４５５℃）下保温，至完成反应检定为止的过程一步工艺就可以完成，从反应开始至性别判定完成约４０分钟，且具有很高的特异性，它采用雄性特异性以及雌雄共同引物，因此可以最大限度排除误判；只需一台Ｌｏｏｐａｍｐ终点浊度仪，就能完成扩增、检出、判定整个过程。王海浪等旧列利用此法对牛早期胚胎进行检测，其性别符合率达到１００％。因此，ＬＡＭＰ法的应用前景十分广阔。

３问题与讨论

性别控制的方法有多种，但各有其优缺点，实际应用性强的方法很少，而大多方法都是针对胚胎的性别鉴定，对于精子的性别分离技术应用较少。如能在受精前做好性别分离，将会大大节约资源和时间，提高性别控制的效率。因此我们应在以后的工作不断改进此项技术，着力于降低成本投入、缩短操作时间、提高准确率、促进应用性等，使其更好地服务于人类经济的发展。

参考文献：

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［２］秦鹏春．哺乳动物胚胎学［Ｍ］．北京：科学出版社．

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［４］张拴林，岳文斌．家畜性别鉴定与控制技术的研究进展［Ｊ］．畜禽业，２０００，５：１５．

［５］马峻，裴轶劲，季维智．哺乳类性别控制的实践与进展［Ｊ］．动物学研究，２００２，２３（２）：１６１—１６５．

［６］王光亚，段恩奎．山羊胚胎工程［Ｍ］．西安：陕西天则出版社，１９９４，１４９—１７９．

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