切除睾丸对昆明小鼠免疫功能的影响

D O I :10.3969/j

.i s s n .1001-5337.2018.4.067 *收稿日期:2018-06-08

基金项目:国家自然科学基金(31370444;31370427);山东省自然科学基金(Z R 2013C M 019). 作者简介:李智渊,女,1991-,硕士生;研究方向:动物学;E -m a i l :1003390493@q q

.c o m ;徐德立,男,1975-,博士,教授;研究方向:动物生理生态学;E -m a i l :x u d l 1975@163.c o m.

切除睾丸对昆明小鼠免疫功能的影响*

李智渊, 徐德立

(曲阜师范大学生命科学学院,273165,

山东省曲阜市) 摘要:

免疫功能障碍假说认为雄性动物表达第二性征的代价是免疫功能受到抑制,为了检验该假说,实验以雄性昆明小鼠为研究对象,通过切除睾丸,来研究其免疫功能是否会发生变化.将18只小鼠随机分为睾丸假切除组(n =9)和睾丸切除组(n =9).发现睾丸切除不影响小鼠的体重和身体成分例如胴体鲜重㊁皮下脂肪㊁肠系膜脂肪㊁腹膜后脂肪㊁性周脂肪和脂肪总重.然而,切除睾丸显著增加了小鼠脾脏和胸腺㊁白细胞总数,从统计学上切除睾丸虽然对天然免疫没有显著性影响,但睾丸切除组的天然免疫比假切除组增加了232.2%,这些结果支持免疫功能障碍假说.另外,切除睾丸抑制了注射P HA 后12h ㊁24h ㊁72h 的P HA 反应,该结果不支持免疫功能障碍假说.脂肪总重与胸腺㊁脾脏㊁白细胞总数和P HA 反应均不存在相关性,

表明脂肪不是这些免疫指标变化的原因.总之,昆明小鼠不同的免疫成分对切除睾丸的反应存在差异,其免疫功能变化的原因还需后续补充睾酮实验进行深入研究.

关键词:睾丸切除;天然免疫;细胞免疫;昆明小鼠

中图分类号:Q 955 文献标识码:A 文章编号:1001-5337(2018)04-0067-06

1 前 言

免疫功能障碍假说认为雄性动物表达第二性征的代价是其免疫功能受到抑制,因此,只有高质量的雄性才能够充分表达第二性特征,同时又不会遭受病原体或寄生虫的攻击,从而在性选择时受到异性

的青睐,提高其适合度[1

].雄性动物免疫受抑制的原因可能在于雄激素睾酮对免疫功能的抑制作用[2].

大多数研究发现睾酮对免疫功能具有抑制作

用[3].

例如,睾酮处理能抑制鸟类的细胞免疫[4]

;睾酮能减缓指示天然免疫能力的伤口愈合速度,而去

除睾丸则可加速伤口愈合[5-7]

.澳大利亚蝙蝠的脾脏大小与睾丸质量呈负相关[8].禽类中的研究表明睾酮对天然免疫具有抑制作用[9-12].

卵内睾酮水平的增加可以抑制幼雏天然免疫反应,并且睾酮处理的

卵孵化出的幼雏抗菌能力降低[13].

然而其他研究者却发现不同的结果,雄性蝾螈去除睾丸和补充睾酮后,其伤口愈合速率不受影响,表明睾酮没有抑制免

疫的作用[14,15]

.

因此,对免疫功能障碍假说的检验,还需在更多物种中进行研究.

细胞免疫是获得性免疫系统的成员,负责控制细

胞内病毒,植物血球凝集素(P h y t o h a e m a g g

l u t i n i n ,P H A )

反应是测定哺乳动物细胞免疫能力的常用指标[16-18

].

天然免疫是免疫系统的另一成员,对所有病原体均有控制作用[16].免疫器官如胸腺和脾脏同样能反映免疫功能[19-21].白细胞总数对抵御病原体的免疫反应至关重要,也常用于健康状况的评估[20].

为了检验免疫功能障碍假说,以雄性昆明小鼠

为研究对象,通过切除睾丸,来研究其免疫功能是否会发生变化.预测,昆明小鼠切除睾丸后,其细胞免疫㊁天然免疫均会增加.

2 材料和方法

2.1 实验设计

实验用雄性昆明小鼠(3月龄)购自于济南朋悦动物有限公司,饲养于曲阜师范大学动物房内.饲养温度为23ʃ1ħ,光周期为12L :12D (L i g

h t : 第44卷 第4期2018年10月 曲阜师范大学学报J o u r n a l o f Q u f u N o r m a l U n i v e r s i t y

V o l .44 N o .4

O c t .2018

D a r k),单笼饲养(30c mˑ15c mˑ20c m),以锯末做垫料,自由取食和饮水,食物为标准大小鼠饲料(北京科奥协力饲料有限公司),单笼适应两周,然后将18只小鼠随机分为睾丸假切除组(n=9)和睾丸切除组(n=9),睾丸切除后12天,处死动物. 2.2身体成分和器官

身体成分和器官的解剖参考以前文献[22].具体来说,将昆明小鼠的内脏器官(心脏㊁肺脏㊁胸腺㊁肝脏㊁脾脏㊁肾脏㊁肾上腺㊁睾丸㊁附睾㊁储精囊)取出,小心地剔除各器官表面的脂肪和结蹄组织,并用吸水纸吸干器官表面的血液,用电子天平称重(精确到0. 001g),即为器官鲜重,去除内脏器官的体重即为胴体鲜重.取出动物的消化道(包括胃㊁小肠㊁肓肠和结肠),小心剔取其周围的脂肪,即为肠系膜脂肪;然后小心地展开小肠㊁盲肠㊁结肠,并用直尺测量其长度(精确到0.1c m),用剪刀剪开各部分后,分别称量胃及内容物㊁小肠及内容物㊁盲肠及内容物和结肠及内容物的重量,之后将其纵向剖开,用生理盐水洗去内容物,并用吸水纸吸去表面水分,称重.仔细地分离出皮下脂肪㊁腹膜后脂肪㊁性周脂肪,这些脂肪总重为总体脂重,脂肪含量等于各部分脂肪重除以胴体鲜重[23].

2.3白细胞数的检测

实验结束后,动物颈部取血,迅速用移液枪取20μL的血液,溶于0.38m L白细胞稀释液(含1.5%的冰醋酸,1%龙胆紫)中,混匀,在低倍显微镜下对白细胞进行计数[24].

2.4细胞免疫的检测

睾丸切除后9天,用数显电子测微尺(T e s a S h o p c a l,瑞士)测定小鼠左后足足垫的厚度(精确到ʃ0.01mm),然后用酒精棉球对左后足足垫进行消毒,在足垫中央注射0.03m L含0.1m g P H A (S i g m aL-8754)的无菌磷酸缓冲液(P B S)缓冲液(p H7.4),注射后6h㊁12h㊁24h㊁48h㊁72h,分别测量每只动物左后足足垫厚度,测量6次,计算平均足垫厚度,P H A反应的计算公式为:(注射后足垫厚度-注射前足垫厚度)/注射前足垫厚度[17,18]. 2.5天然免疫的检测

血清杀菌能力是用来测定动物清除细菌感染的能力.通过测定大肠杆菌与血清孵育生长之后,形成菌落数的差异来反映血清杀菌能力的差异[25,26].首先制备细菌储备液,在40m L1m o l/L无菌P B S溶液加入一个大肠杆菌冻干颗粒,混匀,在37ħ孵育30m i n;然后将2m L细菌储备液与8m L1m o l/L P B S混匀,即为细菌工作液.将样品血清与C O2非依赖培养基(G i b c o n o.18045,C a r l s b a d,G A,U S A)按1ʒ20比例的稀释,然后在稀释好的样品中加入20μL细菌工作液,混匀,在37ħ孵育30m i n;然后从样品中取50μL混合液,加至胰蛋白酶大豆琼脂糖平板上,用涂布器涂匀,在37ħ培养箱倒置过夜培养,每个样品做2个重复,然后对每个平板进行菌落计数,并求平均值.杀菌能力按以下公式计算:1-(每一个样品的平均菌落数/阳性对照的平均菌落数),阳性对照仅包含培养基和细菌工作液[27]. 2.6统计分析

数据统计采用S P S S13.0软件进行分析,分析前先用O n e-s a m p l e K o l m o g o r o v-S i m i r n o vt e s t检验数据是否呈正态分布.比值包括P H A反应㊁脂含量用反正弦转换后用独立样本t-检验(I n d e-p e n d e n t-s a m p l e s t-t e s t)分析睾丸假切除组和切除组之间的差异,任一时间点体重的差异用独立样本t-检验进行分析.胸腺和脾脏的组间差异用以体重为协变量的多因变量线性模型方差分析(G e n e r a l L i n e a rM o d e lm u l t i v a r i a t e a n a l y s i s,G L M)进行,然后用B o n f e r r o n i p o s th o c进行检验.其它指标包括身体成分㊁白细胞数等用独立样本t-检验进行分析. P H A反应㊁白细胞数㊁免疫器官与体脂重的相关关系用皮尔逊相关分析(P e a r s o n c o r r e l a t i o na n a l y s i s)进行.结果以平均值ʃ标准误(M e a nʃS E)表示,P <0.05为差异显著.

3结果

3.1体重

切除睾丸前,两组小鼠的体重没有显著差异(t =-0.123,d f=16,P=0.903),从切除后D a y1(t =1.323,d f=16,P=0.204)到D a y12(t= -0.794,d f=16,P=0.439)之间的任意时间点,切除睾丸均对小鼠体重没有显著影响(图1).

图1切除睾丸对昆明小鼠体重的影响

86曲阜师范大学学报(自然科学版)2018年