植物激素脱落酸受体的研究进展

植物学通报 2006, 23 (6): 718￣724收稿日期: 2006-02-17; 接受日期: 2006-06-28基金项目: 国家自然科学基金(No.30370765)

* Author for correspondence. E-mail: cpyao@https://www.360docs.net/doc/e15055915.html,

．专题介绍．

植物激素脱落酸受体的研究进展

姚春鹏＊，李娜

河南大学生命科学学院, 河南省植物逆境生物学重点实验室, 开封 475001

摘要 脱落酸(abscisic acid, ABA)广泛参与植物生长发育的调控和对多种环境胁迫的适应性反应。有关ABA 受体的研究已经在检测受体位置、纯化ABA 特异性的结合蛋白和克隆ABA 受体基因方面做出了许多重要的工作。最近相继发现一种RNA 结合蛋白FCA 和一种编码Mg 离子螯合酶（Mg-chelatase ）H 亚基的CHLH 作为两种不同的ABA 受体分别调控植物的开花时间和介导种子萌发、幼苗生长及叶片的气孔运动。本文从实验策略的角度重点分析总结了研究脱落酸受体相对有效的途径与方法, 同时就有关的研究结果给予了评论和展望。

关键词 脱落酸, 感受位点, 结合蛋白, 受体, 基因

Research Advances on Abscisic Acid Receptor

Chunpeng Yao *, Na Li

College of Life Sciences , Henan University , Henan Key Laboratory of Plant Stress Biology , Kaifeng 475001, China

Abstract Abscisic acid (ABA) regulates various physiological processes of plant growth and development,besides mediating adaptive responses to diverse environmental stresses. Great effort has been made in detecting ABA perception sites, identifying the specifically binding-protein(s) and cloning the receptor gene(s). An RNA-binding protein, FCA and a Mg-chelatase H subunit, CHLH, had been recently identified as two ABA receptors in controlling plant flowering time and regulating seed germination seedling growth and stomatal movement, respectively. This article summarizes the practical approaches employed in exploring putative ABA receptor(s) and discusses the prospects for future investigations.Key words abscisic acid, perception site, binding-protein, receptor, gene

作为一种植物激素, 脱落酸(abscisic acid,ABA)调控植物生长发育的许多方面, 如调节植物的胚胎发育、种子休眠与萌发、气孔关闭、开花时间和果实成熟等生理过程以及植物对干旱、盐碱、低温、高温、紫外辐射和病原侵袭等多种胁迫的适应性反应。ABA 信号转导和作用机制的研究一直是植物逆境生物学的重要课题, 现已鉴定出许多重要的ABA 信号转导元件, 包括蛋白激酶、磷酸酶、离子

通道和Ca 2+ 等(Giraudat et al., 1994; Leung and Giraudat, 1998; Rock, 2000; Finkelstein et al., 2002;吴耀荣和谢旗, 2006)。对于ABA 的感受机制,在最近终于有了突破性的进展, 继Razem 等(2006)报道一种RNA 结合蛋白FCA 作为ABA 受体调控植物开花的时间之后，不久前Shen 等(2006)又宣布一种编码Mg 离子螯合酶(Mg-chelatase)H 亚基的CHLH 作为另一种ABA 受体介导种子萌发、幼苗生长和叶片

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气孔的运动。

为了进一步总结ABA受体研究的进展, 本文主要讨论ABA受体研究过程中不同的研究思路和结果, 重点介绍ABA作用位点的检测、ABA特异性结合蛋白的鉴定和潜在受体基因的克隆, 并分析将来研究工作的发展趋势。

１ 检测ＡＢＡ感受／作用位点

通常认为ABA作为一种激素信号首先在细胞的某个位点被感知, 和受体特异结合后启动后续的生理生化反应。由于ABA是一种含15个碳的倍半萜羧酸(pKa=4.8), 在较酸性的pH条件下表现为亲脂性的分子(ABAH)而容易透过质膜进入胞质溶胶中; 在较高的pH条件下表现为亲水性离子态(ABA-)则难以进入胞质而留在质外体。基于这种特性, 以鸭趾草保卫细胞作为模式系统, 在特定pH条件下分别采用胞外施用和胞内显微注射外源ABA的方法, 对比观察ABA引起的气孔开度的变化, 分别得出了ABA 感受位点位于细胞质膜外和细胞质内两种不同的实验结论(Anderson et al., 1994; Allan et al., 1994; Schwartz et al., 1994), 并且都有其他相关实验提供有力支持。Gilroy和Jones(1994)在大麦糊粉层细胞原生质体外施ABA可明显拮抗赤霉素对α-淀粉酶合成与分泌的诱导, 而用显微注射法使胞内ABA浓度升高到250 μmol.L－1却没能产生拮抗效应, 这与Anderson等(1994)的实验设计类似, 结果明显证明了ABA感受位点位于质膜外侧; Schwartz等(1994)与Gosti等(2000)利用膜片钳技术检测分析了ABA对内向K+通道和Ca2+电流的影响, 则对胞质内存在ABA感受位点提供了电生理学证据(Gilroy and Jones, 1994; Schwartz et al., 1994; Gosti et al., 2000)。

鉴于在植物体内ABA既存在多种抑制效应又有多种促进效应, 人们猜测可能同时存在两类感受位点。后来研究发现 86Rb+从保卫细胞的流出既受到胞内ABA又受到胞外ABA的诱导, 进一步证实胞内外均存在ABA的受体位点(MacRobbie, 1995)。

Yamazaki等(2003)采用生物素标记的ABA 和荧光标记的生物素抗体处理蚕豆保卫细胞原生质体, 通过激光扫描显微镜和流式细胞仪非常直观地揭示出ABA感受位点在质膜上的空间分布, 丰富了人们对质膜上ABA受体的认识, 也为揭示胞质内ABA受体的动态分布提供了新思路。

２ 鉴定ＡＢＡ特异性结合蛋白

传统上人们认为ABA受体是蛋白质, 受体蛋白为配基ABA特异性结合蛋白。通常膜上的受体为难溶的整合蛋白, 胞质内受体则为可溶性蛋白。从目前的研究来看, ABA受体应该包含膜上受体和胞质内受体两类, ABA受体蛋白的分离和鉴定也同样存在蛋白相对含量非常低、膜上整合蛋白不易溶解以及难以保持受体本来的敏感性等制约因素。

放射配基结合分析法作为研究配基与受体相互作用的传统核心技术, 在早期研究ABA特异性结合蛋白上得到了很广泛的应用。利用同位素标记的ABA(3H-(±)-ABA)先后于蚕豆叶片亚细胞组分(Hocking et al., 1978)、蚕豆保卫细胞原生质体膜(Hornberg and Weiler, 1984)、水稻幼叶(陈瑞等, 1992)、玉米糊粉层胞质组分(Bai et al., 1994)、玉米根微粒体组分(陈珈等, 1997)和苹果果肉(Zhang et al., 2001)中发现了ABA特异性的结合蛋白。

除Veliev(1991)利用放射免疫法在小麦茎胞质部分发现了与ABA高亲和结合的蛋白质外,亲和层析技术也发展出一系列探针用于检测和纯化ABA结合蛋白, 并在拟南芥微粒体膜(Pedron et al., 1998)、蚕豆叶片(Zhang et al., 2002)和大麦糊粉层(Razem et al., 2004)检测到了ABA高亲和蛋白。

尽管已经在7种植物中发现了10个ABA 特异的结合蛋白或蛋白性结合位点, 但对这些结

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合位点进行纯化鉴定的文献一直很少。继Zhang等(2002)首次报道采用亲和层析法从蚕豆叶片中纯化出具有潜在ABA受体特性的结合蛋白之后, 迄今只有Razem等(2004)又报道纯化出体外表达的具有潜在ABA受体特征的大麦糊粉蛋白(Zhang et al., 2002)。

目前看来, 分离纯化ABA受体蛋白的最有效方法应该是亲和层析法。该法包含多种形式, 但其基本原理都是以蛋白质和结合在介质上的配基之间的特异性亲和力为实验基础。ABA通常通过载体蛋白(如牛血清蛋白, bovine serum albumin, BSA)或者一段经过特殊化学修饰的连接物作为间隔臂偶联到载体介质(如sepharose)上进行纯化操作(Pedron et al., 1998; Zhang et al., 2002)。Razem等(2004)通过一系列蛋白-配基结合分析实验发现蛋白(ABAP1)与ABA的结合具有可饱和性、可逆性、特异性和高亲和力等特征, Western-blot显示ABAP1为糊粉细胞质膜组分, Southern-blot显示ABAP1在小麦、苜蓿、烟草、芥菜和豌豆等多种单子叶和双子叶植物中都有同源基因(Razem et al., 2004)。

理论上, 受体蛋白与配基的结合都具有可饱和性、可逆性、特异性和高亲和力等特征,但这只能是鉴定受体的必要条件而非充分条件,没有与相应的生理功能联系起来依然很难定论和让人信服。所以Zhang 等(2002)和Razem等(2004)各自所在的实验室在纯化到ABA特异性的结合蛋白之后分别时隔4年和2年最终才鉴定出相应ABA的受体。

３ 寻找ＡＢＡ受体基因

遗传学和分子生物学特别是植物基因组学的快速发展积累了大量的生物信息资源和突变体资源, 这为人们直接分离鉴定ABA受体基因从而在生理学和分子生物学水平上综合进行基因功能鉴定提供了极大的便利。

3.1 突变体筛选

植物激素的信号转导是以受体感受激素信号为起点, 生理反应或表型产生为终点。通过化学或物理诱变, 筛选出对激素响应表现异常的突变体后克隆基因并分析其功能, 确定突变基因在激素信号转导中的位置, 这在植物激素乙烯受体和细胞分裂素受体以及蓝光受体的研究中都已有很成功的范例(Briggs and Olney, 2001; Heyl and Schmulling, 2003; Chen et al., 2005),理论上和技术上都为寻找ABA受体突变体提供了良好的研究依据。

然而, 从20世纪80年代至今, 根据玉米特别是模式植物拟南芥在种子休眠、萌发、气孔关闭、根生长和幼苗发育等过程中对ABA、生长素、油菜素内酯和乙烯等植物激素敏感性异常(不敏感或超敏感)以及对糖、盐、旱和冷等胁迫反应异常(表型异常或基因表达异常), 已经筛选出60多种突变体, 得到编码基因20多个, 功能鉴定均为ABA信号转导中间元件而非ABA受体基因(Merlot and Giraudat, 1997; Leung and Giraudat, 1998; Finkelsteina et al., 2002; Nambara et al., 2002)。尤其是Nambara 等(2002)以ABA类似物筛选对ABA立体异构体(-)-ABA和(+)-ABA敏感性不同的突变体, 以求获得受体基因突变体, 在筛选策略上侧重于ABA的感受, 然而至今还没有真正的突破性报道(Nambara et al., 2002)。

3.2 文库表达筛选

Razem等(2004)采用抗-抗ABA抗体(也称Ab2)筛选ABA处理过的大麦糊粉层的cDNA表达文库, 获得一全长cDNA(aba33)之后, 又进行体外富集表达和蛋白特性鉴定。Liu等(1999)曾以同样的实验方法从ABA处理过的大麦糊粉层的cDNA表达文库中分离出一全长cDNA (aba45), Northern-blot显示aba45 mRNA在发育中的糊粉层细胞和胚中丰富表达, 而在大麦根、茎和叶中则没有检测到, 同时发现aba45受ABA上调诱导和赤霉素下调诱导(Liu et al., 1999)。事实上, 早在1998年, 郑志富等就曾采

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用抗ABA结合蛋白(ABBP)血清作为探针筛选玉米cDNA表达文库, 从20万个独立噬斑中, 获得1个编码多肽的cDNA克隆, 它与动物的某些核酸结合蛋白基因的同源性高达60%～65%。由于该抗血清不仅能识别ABBP, 还能识别rRNA, 暗示该蛋白可能作为一种细胞质内ABA 受体与核糖核酸结合, 在转录和翻译水平上调控基因表达(郑志富等, 1998)。这种方法将免疫技术特有的专一性和高度的灵敏性与现代基因表达分析技术的灵活性相结合, 在寻找ABA受体基因与蛋白的手段上是独特而高效的。但郑志富等(1998)和Liu等(1999)均未有后续深入研究的突破性报道, 而Razem等(2006)则在对纯化蛋白测序的基础上发现ABAP1与一种已知的RNA结合蛋白FCA的氨基酸序列相似, 他们以此为突破口鉴定出FCA作为一种ABA受体调控植物开花的时间, 最终在ABA受体领域取得突破性进展(Macknight et al., 1997; Razem et al., 2006)。

与利用复杂的免疫抗体作探针筛选cDNA 表达文库不同, Leyman等(1999)借鉴动物受体研究中已有的成功策略(Takahashi et al., 1987; Browaeys-Poly et al.,1998), 从干旱胁迫处理的烟草叶中提取总mRNA后, 显微注射到爪蟾卵母细胞中进行异源表达, 发现存在响应ABA(20μmol.L－1 ABA处理)的能激活卵母内源Ca2+依赖的Cl－电流的蛋白后, 构建相应的cDNA文库再经卵母表达和亚克隆表达筛选后获得Nt-SYR1基因, 电生理学和分子生物学实验结果显示其蛋白产物可能在ABA信号转导早期扮演很重要的角色(Leyman et al., 1999)。这种运用爪蟾卵母细胞进行基因的表达筛选, 可以获得很多常规方法无法得到的克隆, 尤其对于受体这种常为膜上的疏水蛋白、含量太低难以得到高纯度蛋白而无法运用合适的核酸探针或抗体进行cDNA文库筛选的基因的克隆更是非常适用,在ABA受体研究中将具有广阔的应用前景(Takahashi et al., 1987)。3.3 基因芯片和表面等离子体生物传感器技术

基因芯片技术是对传统生物技术如基因检测、核酸杂交、分型和测序等技术的重大融合与升级,具有快速、高效和高通量等特点, 在检测差异表达基因和筛选新基因等方面具有强大优势(Schena et al., 1995; Eisen and Brown, 1999; Schenk et al., 2000)。在鉴定ABA应答基因、响应逆境胁迫的基因以及分析ABA信号转导中间元件的表达研究中也已得到成功应用(Seki et al., 2002; Leonhardt et al., 2004; Philip et al., 2004; Osakabe et al., 2005)。特别是Osakabe等(2005)借助cDNA芯片技术分析RPK1突变体和反义-RPK1转基因植株中目前已知的大量受ABA诱导的基因的表达模式, 结果发现几乎所有受ABA诱导的基因都被下调, 从而辅助鉴定出RPK1位于ABA信号转导级联反应的早期位置, 很可能是介导ABA感受或者是ABA受体复合物的成分。

另外, Desikan等(1999)曾利用表面等离子体生物传感器技术, 在水稻细胞原生质体上发现了一参与ABA信号转导的与JIM19(Knox et al., 1995)相互作用的膜复合物。随着表面等离子体生物传感器的改进，目前人们已经能够利用该仪器在无标记的情况下实时地对粗提的生物分子进行包括蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA、DNA与DNA、抗原与抗体以及受体与配体之间相互作用的研究(Schuck, 1997)，这无疑为ABA受体及其信号转导的研究提供了一种较为强大和便利的工具。

４ 展望

ABA受体研究对于深入了解植物生长发育及逆境适应性调节的分子生理机制具有重要的科学价值和社会意义, 是植物学研究的重点、难点和热点之一, 受到国内外许多实验室的密切关注。现已采用了大量先进的生理学和分子生物学实验仪器及技术手段, 做出了颇有价

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值的工作。揭示出ABA感受位点不仅有助于阐明受体的分布, 也为进一步分离纯化受体蛋白提供了必要的理论依据; 通过分离纯化ABA 特异性结合蛋白来克隆受体基因是最直接最传统的分离蛋白编码基因的方法; 而分子生物学和基因组学的迅猛发展则为直接进行受体基因克隆提供了更便利的途径。虽然长期以来一直没有获得突破性进展, 但前人的探索却为今后的研究奠定了有利的基础。

迄今, 通过遗传学的方法已经克隆了许多ABA应答基因, 但一直没有筛选到ABA受体基因突变体。从其他动植物受体的研究结果来看, ABA受体很可能是由冗余基因或者胚胎/配子致死突变基因编码, 也可能存在种内外差异和时空表达的差异(不同生长阶段组织或细胞的ABA受体特性不同); 对于前一种情况有必要调整突变体的构建和筛选方法, 如最近发展起来的激活标签法在解析基因家族的功能方面已经表现出很好的前景(Nakazawa et al., 2003)。对于后一种情况则应充分考虑ABA受体结构与作用机制的复杂性, ABA受体很可能并不都像传统上认为的仅仅是一种简单的功能蛋白, 它在与ABA结合后可能激活或抑制一种也可能是几种信号转导途径; 同时, 可能某些ABA受体是一些蛋白复合物或蛋白复合物的某个亚单位而这些蛋白复合物又是由某些相同或不同的亚单位组合构成; 正如生物化学中的同工酶一样, 这些ABA受体都能和ABA特异结合, 但是它们的理化性质、调控的信号转导途径以及反应机理却差别很大甚至完全不同。

ABA参与的生理过程错综复杂, 其功能的多效性也暗示植物体中存在着受体的多样性。ABA在植物生命活动中起着重要而复杂的作用, 长期的进化选择压力必然形成了一套严密协调的作用机制。在各种实验系统中, ABA最适浓度差异很大, 对于不同组织其产生的效应甚至相反。对ABA结构类似物的研究表明, 在ABA 不同的反应中对ABA立体化学结构的要求有所不同, 进一步暗示高等植物体内存在着多种类型的ABA受体(Walker-Simmons et al., 1997; Kim et al., 1999)。

Razem等(2006)应用前人的策略, 借助目前普遍应用的生物信息学分析方法和生物化学与分子生物学实验技术, 首次鉴定出一个早在1997年就已经报道过的与植物开花有关的RNA结合蛋白FCA作为一种ABA受体调控植物开花的时间。该受体介导ABA对开花时间的调控, 但并不参与ABA调节的种子萌发和气孔关闭的反应途径, 暗示在植物体内肯定还存在其他类型的ABA受体。这种科学推测很快被中国农业大学张大鹏课题组的研究结果所证实。他们利用之前从蚕豆叶片中得到的ABA 特异性结合蛋白ABAR的序列信息，研究了拟南芥中相应的同源基因的功能。结果发现拟南芥中ABAR与ABA也具有受体-配基结合特性;通过转基因上调ABAR的表达(over-expressing ABAR)后，植物在种子萌发、幼苗生长和气孔运动方面对ABA“超敏感”; 而通过转基因(RNAi, ABAR反义)下调ABAR的表达后植物在种子萌发、幼苗生长和气孔运动方面对ABA反应“不敏感”; 同时发现ABAR 的T-DNA插入敲除突变体由于种子不能正常成熟，是致死突变；由于ABAR蛋白的基因被报道编码M g离子螯合酶的H亚基——CHLH，是叶绿素的生物合成以及植物质体向细胞核信号转导过程的关键元件，他们又研究了叶绿素合成和质体-核信号转导相关的突变体，结果发现如果突变不影响ABAR/CHLH 的表达，就不影响植物对ABA信号的响应，从而证明了ABAR是一个ABA受体，其介导的ABA信号转导是一个独立于叶绿素合成和质体-核信号转导的不同的细胞信号过程。(Shen et al., 2006)。

Razem等(2006)和Shen等(2006)的重要发现为ABA受体及其信号转导的研究开辟了新的思路和研究方向，如进一步鉴定FCA和ABAR/

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CHLH中ABA结合区的保守序列及其同源序列分析、充分挖掘分析FCA和ABA/CHLH同源基因的功能以及寻找受体下游的效应子等。相信随着生物化学、基因组学、蛋白质组学和生物信息学的发展及新技术的应用, 最终会全面揭示ABA受体及其调节相关生物学过程的分子机制。

致谢 导师宋纯鹏教授对本文写作给予了宝贵指导, 在此表示诚挚的感谢！

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(责任编辑: 孙冬花)