天然功能性食品添加剂——酪蛋白磷酸肽的研究进展

天然功能性食品添加剂——酪蛋白磷酸肽的研究进展

摘要：酪蛋白磷酸肽( CPPs) 是含有成簇的磷酸丝氨酸的生物活性肽，现已证明， CPPs 具有重要生理功能。本文就 CPPs 的结构、理化性质、制备工艺、检测方法、生理功能及应用进行了系统的概述。

关键词：酪蛋白磷酸肽；结构；制备；生理功能；应用

引言

酪蛋白磷酸肽（Casein Phosphope Ptides，CPPs）是以牛奶酪蛋白为原料，经过单一或复合蛋白酶的水解，再对水解产物分离纯化后得到的含有磷酸丝氨酸簇的天然生理活性肽[1]。CPPs能促进机体肠粘膜对钙、铁、锌和硒，尤其是钙的吸收和利用，被誉为“矿物质载体”。CPPs是目前唯一促进钙吸收的活性肽，同时在提高机体免疫力、改善繁殖性能等方面也有重要作用。日本、德国等国家已把CPPs定为功能性食品，与CPPs相关的研究越来越受到我国科学家和食品工作者的广泛关注。

1 CPPs的结构

牛乳酪蛋白的主要成分为αs1、αs2、β和κ-酪蛋白，除κ一酪蛋白外，α和β一酪蛋白都具有成簇存在的磷酸丝氨酸残基(Ser一P)。酪蛋白经体外酶水解后，产生CPPs，CPPs的核心部位是由3个磷酸丝氨酸残基组成的一个一Ser(P)一残基簇，后面紧接着2个一Glu一残基，即一serP一SerP一SerP一Glu一Glu一，现已证明这个结构是发挥其生物活性必不可少的。

Hiroshil等1974年用动物实验表明，酪蛋白可在动物体内形成CPPs，并确定其结构为serP一serP-SerP一Glu一Ile一Pro一Asn。1996年Nieholasf 习等用胰蛋白酶水解酪蛋白，得到包含有一SerP一SerP一SerP-Glu一Glu一序列的CPPs，从而得知了CPPs实际上是一类含有磷酸丝氨酸和谷氨酸的短肽，其产品分子量不均一[2]。

2 CPPs的理化性质

2.1 溶解性 CPPs 产品具有良好的溶解性，其pH值为2.0～10.0，其溶解性除在pH值4.0 约为90%外，其他均高于90%，且溶解性随 pH 值的增高而增大。

2.2 起泡性 CPPs 产品较酪蛋白具有更好的起泡性和泡沫稳定性。

2.3 乳化力 CPPs 产品乳化力较好。但与酪蛋白相比有所下降。同时，CPPs 产品的乳化性和乳化稳定性与酪蛋白相比，分别下降了2.89%和1.45倍。

2.4 热稳定性在 CPPs 产品加工时可以进行有效的杀菌处理，在100 ℃ 30 min 条件下杀菌不会使产品外观改变。CPPs作为钙、铁吸收促进剂，Ca2 +的存在不会影响产品的色泽[3］。

3 CPPs的制备工艺

在 Hannu 等［4］的一项研究中总结了制备生物活性肽(包括CPPs)的途径主要有以下 3 种: 一是在体内通过消化酶的水解，二是用有蛋白水解性的微生

物发酵剂进行发酵乳类，三是利用蛋白酶的水解。除了以上几种酶水解的方法外，重组 DNA 技术也可以用来制得人类所需要的肽段或其前体，某研究者于1999 年成功地从 Escherichia colt中表达重组了人类的αS1-酪蛋白，并分离纯化了它。

传统的工业生产CPPs 一般以酪蛋白或牛奶为原料, 用蛋白酶水解, 使CPPs 游离, 用离子交换法或酶法脱除苦味成分, 制备低纯度产品。高纯度产品可采用膜分离、离子交换法、反向高效液相色谱法等手段进行精制。近年来发展起一种制备 CPPs 的方法是微生物发酵法, 即直接利用微生物发酵过程中产生的蛋白酶(复合)降解蛋白质, 可达到较高的水解度, 从而相对地降低酶法生产活性肽的成本[5]。

目前一般采用具专一性蛋白酶如胰蛋白酶, 胃蛋白酶-胰蛋白酶, 凝乳酶-胰蛋白酶, 碱性蛋白酶等水解酪蛋白制取 CPP。CPP的分离方法有钙-乙醇沉淀法、膜分离法、离子交换法等。常用的方法为钙-乙醇沉淀法,工艺流程见图1 [6]:

4 CPPs的检测方法

目前，CPPs 的检测通常采用反相高效液相色谱法( RP-HPLC 法) 或高效液相毛细管区带电泳法( HPEC) 进行分离，并结合末端氨基酸分析技术以确定各种磷酸肽的一级结构。Le-mieux［7］将分子筛色谱与反相 HPLC 联用，成功分离并鉴定多种 CPPs。通过钼蓝比色法等可测定 CPPs 中磷酸基团的含量。Miquel 等［8］采用 RP- HPLC- ESI- MS /MS 第 1 次成功地分离出12 种 CPPs。

我国分离技术较为落后，庞广昌等［9］对直接定磷法，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS- PAGE) 法，聚丙烯酰胺等电聚焦电泳( IFE) 法进行比较，这 3 种方法均可对 CPPs 进行定量测定，分别适用于产量测定、组分测定和较精确测定。2002 年周杏琴等［10］用反相 C18 液相制备色谱柱，经过2次不同梯度的洗脱，得到了4 种不同组分的 CPPs。这些方法都需要昂贵的仪器和药品，且要求较高

的操作技术，因此，CPPs检测方法的简化仍需要进一步研究。

5 CPPs的生理功能及作用机理

5.1 促进肠道对矿物元素的吸收和利用

早在20世纪40年代 Mellander等首次从酪蛋白的胰蛋白酶水解产物分离到磷酸肽，并证明这些肽的钙盐在生理pH值下具有非常好的溶解性，无论正常婴儿还是佝偻病患儿，对CPPs形式的钙比对自然条件下的钙都能更好地利用。研究发现 CPPs可增加钙的生物利用率，在缺乏维生素D情况下，患有佝偻病小孩服用酪蛋白经胰蛋白酶消化的产物可强化骨骼钙化[5]。动物实验证明，CPPs 可在中性或偏碱性条件下阻止钙的沉淀，从而促进钙在小肠中吸收。

CPPs 虽可抑制磷酸钙形成沉淀，却不能使已形成磷酸钙溶解，CPPs 的结构，特别是其分子内亲水和疏水氨基酸的排布决定了它在磷酸钙晶体增长中是一个重要的调节因子。此外 CPPs 还可促进铁、锰、锌、硒等吸收[11]。

CPPs 促进矿物质吸收的机制是: CPPs 带有较多负电荷，既可以抵抗消化道中各种酶的水解，又可以通过 Ser- P 与 Ca、Fe等离子螫合形成可溶物，从而

3 －结合形成磷酸盐有效地防止溶解的金属离子在小肠中性或偏碱环境中与 PO

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沉淀。同时，CPPs 还可以有效地增加矿物质在体内的滞留时间，最终由于矿物质离子浓度的提高而促进矿物质的被动吸收[12]。

5.2防龋齿, 促进牙齿、骨骼中钙的沉积和钙化

一般认为，酪蛋白磷酸肽促进钙沉积和骨骼、牙齿钙化的原因是它在提高钙吸收、利用的同时，减少了破骨细胞的作用，抑制了骨的再吸收[13]。

牙釉质表层的脱矿和再矿化是一个动态变化的过程。研究表明，酪蛋白磷酸肽具有明显的抗蛀牙功能，可用于防止和治疗牙结石。酪蛋白磷酸肽在溶液中能与钙磷结合成复合体，即酪蛋白磷酸肽钙磷复合体。它是可溶性复合物，附着在龋齿损坏处，维持高水平的钙离子浓度，促使钙离子进入龋损区，促进早期龋损再矿化，从而有效地防止牙蚀细菌的侵蚀，达到抗龋齿的作用［14］。

Cross等[15]研究证明早期牙釉质损伤的修复是源于酪蛋白磷酸肽（CPP）与无定形磷酸钙（ACP）形成的稳定复合物。CPP形成磷酸钙运载工具，这阻止了牙釉质去矿化并促进了再矿化。

Yamaguchi等[16]通过超声波脉冲在不破坏情况下测定牙釉质结构的去矿化和再矿化，得出结论高浓度CPP–ACP中含有的无机成分可增强牙釉质的再矿化。

目前，用酪蛋白磷酸肽制成的抗龋齿添加剂是唯一不同于氟化物的添加剂。

5.3 促进受精能力，提高繁殖性能

关于CPP促进受精能力,提高繁殖性能的报道较少。Nagai等(1994)报道,CPP 能提高精子和卵细胞的受精率。他们发现,含CPP培养液中的精子明显比其他组具有更高的穿透卵细胞的能力,进一步试验发现,这些精子对钙的吸收能力强于对照组。此外,CPP还能减少精子的变异程度而使胚胎发育更加稳定。姜毓君等(2004)研究表明,重组β-CPP二聚体能使家兔精子细胞内的游离Ca2+浓度明显升高(P<0.01),表明重组β-CPP二聚体和天然CPP一样,均可起到促进精子细胞对Ca2+吸收的作用；而且与阴性对照组相比,重组β-CPP二聚体升高精子细胞内的游离Ca2+浓度的作用较天然蛋白更为明显(P<0.01对P<0.05)。同时得出,初步纯化的表达产物与阴性对照相比,对家兔精子细胞表现出差异极显著的促进Ca2+吸收的作用,而精子细胞内Ca2+水平的提高将大大提高精子细胞的获能作