葡萄糖醛酸酶提取及其活性研究

图4 氮源对产酶的影响 Fig.4 The influence of nitrogen source producing enzyme
由图4可以看出胰蛋白胨是比较适合该菌产酶的 氮源，大豆蛋白比较差，蛋白胨最差。在实际发酵实验 中,选取添加量为1 %的胰蛋白胨作为优化后的氮源。
通过试验可得优化发酵培养基：酵母膏 0.5 % 、胰 蛋白胨、1 %NaCl 0.5 %、淀粉5 %、pH 7.2~7.4。 2.3.2 发酵培养条件的选择 2.3.2.1 通气量对产酶的影响
收稿日期：2010-11-07
生物工程
王振强，等：β-葡萄糖醛酸酶提取及其活性研究
149
TG328A分析天平、YP型电子天平：上海天平仪器厂； 4 ℃）,取上清液；7）在405 nm波长下用空白校正零点后
752分光光度计：上海光谱仪器有限公司；95- 1磁力搅 测定样品液的OD值。
拌器：上海司乐仪器厂；HZS- H水浴振荡器：哈尔滨东 1.3.3 β- 葡萄糖醛酸酶提取工艺
150
王振强，等：β-葡萄糖醛酸酶提取及其活性研究
生物工程
基- β- 葡萄糖醛酸苷钠盐，游离出的对硝基酚呈黄 优化后的碳源。
色，可用分光光度计在405 nm波长处测定。
2.3.1.2 氮源的选择
2.2.3 对硝基酚标准曲线绘制
原发酵培养基：酵母膏0.5 %、淀粉5 %、NaCl 0.5 %、
在一定浓度范围内，对硝基酚浓度与吸光度值呈 pH 7.2~7.4，121 ℃灭菌20 min。在原发酵培养基的基础
正比，通过测定对硝基酚浓度与吸光度值标准曲线，由 上，选用蛋白胨、胰蛋白胨和大豆蛋白作为氮源，添加
吸光度值查标准曲线的对硝基酚浓度，进行对酶活性 量为1 %、发酵液 50 mL/250 mL三角瓶。37 ℃水浴振荡
的换算。
培养（110 r/min）,于6 h取样检测,结果见图4。
标准曲线方程: y=0.005 9x- 0.012 4：溶液浓度；y为
判断大肠杆菌的存在，该法具有快速、特异性强、价格 琼脂粉：日本进口分装；甘油磷酸钠：中国医药上海化
低廉、灵敏度高等优点，不仅用于大肠杆菌的快速定性 学试剂公司；无水葡萄糖：天津市北辰液化化学试剂
wenku.baidu.com
检测，还可达到定量检测。大肠杆菌作为一种危害性较 厂；胰蛋白胨：北京双旋微生物培养基制品厂；硫酸铵、
强的致病菌，对于人类的身体健康构成了很大的威胁， 乙醇：天津天大化工实验厂；磷酸：天津四通化工厂；考
取大肠杆菌斜面培养基1支，以无菌操作挑取适 体培养基中，为其提供适宜的培养条件后，在不同的培
量菌苔（两环），接入种子培养液中。
养时间内，取样检测细菌的数目及其性状，发现其生长
1.3.1.2 校正零点
过程呈现一定的规律性，以培养时间为横坐标，培养物
将蒸馏水倾倒入比色皿中，选用650 nm波长分光 中活菌数的对数为纵坐标，可得出一条曲线，即为生长
吸光度。对硝基酚的颜色与溶液pH有很大关系，pH越
大 ，溶 液 颜 色 越 深 ，因 而 测 定 酶 活 性 时 ，必 须 先 将 待
酶活/U
测液pH统一调至7.0，以消除因pH影响而产生的颜色
误差。
OD405 nm
对硝基酚含量（/ μmol/L） 图2 对硝基酚标准曲线 Fig.2 P-nitrophenol standard curve
在250 mL三角瓶中分别装入30、50、70 mL优化发 酵培养基,按2 %的接种量接种。于110 r/min旋转水浴 摇床37 ℃振荡培养，在6 h取样，4 ℃下离心，转速为 3 000 r/min，离心15 min，除去菌体。用对硝基酚- β- 葡 萄糖醛酸酐酶底物法测上清的酶活力见图5。
为底物。 2.2.2 测定原理[5]
对硝基苯基- β- 葡萄糖醛酸苷钠盐 β-葡萄糖醛酸酶
4 ℃）,取上清液；6）待4）中样品保温结束后，取出，每管 对硝基酚 +β- 葡萄糖醛酸苷钠盐
加入0.4 mL 0.1 mol/L的NaOH; 离心（10 000 r/min，5 min，
大肠杆菌所具有的葡萄糖醛酸酶水解对硝基苯
以培养时间为横坐标，OD值为纵坐标作图，绘制 E.coli生长曲线。
时间/h 图1 E.coli的生长曲线 Fig.1 The growth curve of E.coli
1.3.2 β- 葡萄糖醛酸酶活性测定步骤[3]
从图1可以看出0 h~4 h为迟缓期，4 h~10 h为对数
1）将培养好的菌液取出，离心（3 000 r/min,20 min, 生长期，10 h以后，菌体的生长进入稳定期。
摘 要：β-葡萄糖醛酸酶（β-G）是大肠杆菌（E. coli）的特异酶，利用酶-底物法测定β-G活性，确定了β-G的最佳发酵 培养基：胰蛋白胨 1 %、淀粉 5 %、NaCl 0.5 %,、酵母膏 0.5 %、pH 7.2～7.4；最佳发酵培养条件：通气量 50 mL/250 mL三 角瓶，转速 110 r/min，并用硫酸铵分级沉淀法对β-G进行提取研究。 关键词：β-葡萄糖醛酸酶；提取；大肠杆菌；活性
联电子科技有限公司；HYG- II回转式恒温调速摇瓶
将E.coli振荡培养6 h至酶活高峰，停止培养，按下
柜：上海欣蕊自动化设备有限公司；LSY电热恒温水浴 锅：北京医疗设备厂；PHSJ- 4A型pH酸度计：美国奥立 龙公司；BS- 自动部分收集器：上海沪西分析仪厂；
面工艺进行提取[4]。
离心
培养液
上清液 加饱和硫酸铵 离心 细胞
上清液
溶解 离心
沉淀
BT00- 300M流量调节器：保定兰格恒流泵有限公司； 沉淀 LRH- 250- A生化培养箱：广东省医疗器械厂。
纯化
1.3 方法
2 结果与讨论
1.3.1 大肠杆菌生长曲线的测定
2.1 大肠杆菌生长曲线的测定
1.3.1.1 接种
取固体斜面E.coli 1环~2环接种于适宜的新鲜液
光度上调节零点，以作测定的空白对照。
曲线。
1.3.1.3 测零时OD值
本试验将E.coli接种于种子培养基中以培养时间
将刚接入大肠杆菌但未振荡培养的培养基倾倒 为横坐标，测得的OD值为纵坐标，绘制E.coli生长曲线
入比色皿中, 在校好零点的分光光度计上测定OD值。 如图1。
此时的OD值即为接种后大肠杆菌生长曲线中的零时
2011 年 7 月
148 第 32 卷第 7 期
食品研究与开发
Food Research And Development
生物工程
β- 葡萄糖醛酸酶提取及其活性研究
王振强1，王振伟1，张耀光2 （1. 黄河水利职业技术学院，河南 开封 475003；2. 河南省疾病预防控制中心，河南 郑州 450016）
1 h；4）吸取2 mL稀释菌液入试管中，加入2 mL 0.05 mol/L 高，且价格不足Sigma公司价格的1/10，因而选择PNPG
pH 7.0 PBS缓冲溶液，作为空白液，（36±1）℃保温1 h； 5）待3）中样品保温结束 后 ，取 出 ，每 管 加 入 0.4 mL 0.1 mol/L的NaOH，终止反应, 离心（10 000 r/min，5 min，
4 ℃）去菌体；2）用干灭过的移液管吸取1 mL的上清菌 2.2 β- 葡萄糖醛酸酶活性测定
液，沿管壁徐徐注入装有9 mL无菌水的试管中，制成 2.2.1 底物选择
1∶10的稀释液，调pH至7；3）吸取2 mL稀释菌液入试管
天津某研究所于2000年合成了对硝基酚- β- 葡
中，加入2 mL底物溶液，作为样品液，（36±1）℃保温 萄糖醛酸苷 （PNPG），纯度与Sigma公司PNPG相比略
New York and Lundon: Academic Press,1969:65-70
Intestinal and Foodborne Pathogens by Lactobacillius acidophilus[J].
Rev Latinoam Microbiol,2006,48(1):24-30
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
372-373
[8] Hobbs B C. Clostridiumperfringers and Bacillus cereus infections[M].
[7] ALY E. Abo -amer. Chomosomal Genes -mediated Inhibition of
Study on Extracting β-Glucuronidase and its Activation WANG Zhen- qiang1, WANG Zhen- wei1, ZHANG Yao- guang2 （1. Yellow River Conservancy Technical Institute，Kaifeng 475003，Henan, China; 2. Henan Center of Disease Control and
因此大肠杆菌快速检测对于保障人类的身体健康具有 重要的意义[2]。
马斯亮蓝G- 250：Amresco公司；对硝基酚- β- D- 葡萄 糖醛酸苷：天津市医药科学研究所。
1.2 仪器与设备
作者简介：王振强（1979—），男（汉），讲师，硕士，研究方向：食品检测 分析教学与研究。
干燥箱：上海实验仪器厂；蒸汽消毒器：山东新华 医疗器械厂；架盘药物天平：北京宣武区天平厂；
食品卫生和食品安全是关系到人民群众的身体 1 材料与方法
健康和生活质量，关系到我国经济发展和社会稳定的 一件大事[1]。β- G是一种酸性水解酶，特异地富含于大
1.1 材料 大肠杆菌：天津公安医院；酵母浸膏、蛋白胨：天津
肠杆菌中，国外早在80年代初开始将β- G的检出用于 英博生化试剂有限公司；琼脂条：北京化学试剂公司；
Prevention，Zhengzhou 450016，Henan, China） Abstract：β- Galactosidase is a specific enzyme of E. coli. This paper determines activity, optimal fermentation culture medium and fermentation culture conditions of β- G with the enzyme- substrate method. The optimal fermentation culture medium consisted of the following: tryptone 1 %, starch 5 %, nacl 0.5 %, yeast extract 0.5 %, pH 7.2- 7.4; the fermentation culture conditions consisted of the following: ventilation, 50 mL/250 mL triangular flask, rotating speed 110 r/min. It was taken a rough collecting research in the way of ammonium sulfate fractional precipitation. Key words：β- Glucuronidase；extract；E.coli；activation
读数值。
1.3.1.4 振荡培养
将接过种的三角瓶放入自控恒温汽浴摇床上振
OD 值
荡培养，温度为37 ℃，转速110 r/min。
1.3.1.5 生长量测定
在培养过程中，每隔2 h从摇床上取下一瓶装有培
养基的三角瓶，将培养基倒入比色皿中，并在分光光度
计上读取OD值。 1.3.1.6 E.coli生长曲线的绘制
2.3 β- 葡萄糖醛酸酶活性测定结果 2.3.1 发酵培养基的优化 2.3.1.1 碳源的选择
原发酵培养基：酵母膏0.5 %、蛋白胨1 %、NaCl 0.5 %、 pH 7.2~7.4，121 ℃灭菌20 min。在原发酵培养基的基础 上，选用淀粉、甘油磷酸钠和无水葡萄糖作为碳源，添 加量为5 %；发酵液 50 mL/250 mL三角瓶。37 ℃水浴振 荡培养（110 r/min），于6 h取样检测，结果见图3。