稀土荧光探针检测多巴胺及类似物

180 160 140 120 100
Fluor
80 60 40 20 0 0.00000 0.00005 0.00010 0.00015 0.00020
CDA/M
A．CDOPAC－Fluro图
B．CDA-Fluro图
实验条件的优化

稀土离子与第一配体的选择： 4. Tb3＋ + DCTA体系 ： 20º C 时， Tb3＋与EDTA的络合常数lgK1 为17.93，而与DCTA的络合常数lgK1为 20.20* 因此本体系可以在更高 pH 下存在，更利 于三重络合物形成
在人体内的正常值 范围为 血浆：＜480pmo1/L； 尿：0-80nmo1/24h
在人体内的正常值范 围为血浆：6153240pmol/L； 尿： 0-590 nmol/24h
对儿茶酚胺的检测手段
检测方法 灵敏度
放射酶学法
HPLC法
2.2×10 -1 0 M
优点
缺点
技术难度高 ，检测速 度慢，危险
pH影响
48 47 46 45
460 440 420 400
Fluor
44 43
Fluor
11.0 11.5 12.0 12.5 13.0
380 360 340
42
320
41
300 280 20 30 40 50 60 70 80
pH
VNaOH/ul
0.4 mmol/L Tb3＋－ DCTA，2×10－5 mol/L DOPAC，横 坐标为pH
稀土荧光探针检测 多巴胺及类似物
答辩人：袁洁 导师：赵美萍 副教授 2003年6月18日
选题背景 已有检测方法综述 实验部分 总结 致谢
儿茶酚胺的结构 及生理意义
儿茶酚胺（catecholamine, CA） 的种类、结构和生理意义 神经递质在单细胞检测中的意义
Dopamine（DA）


实验结果
B Data1B
250
400 350 300
B Data1B
200
250
150
Fluro
Fluro
200 150 100
100
50
50
0 0.000000 0.000002 0.000004 0.000006
-1
0 0.000000 0.000002 0.000004 0.000006
-1
0.9988
0.9992
0.9967
0.9982
5.2×10－ 3.6×10－ 5.7×10－ 2.97×10 8 mol/L 8 mol/L 8 mol/L －8 mol/L
总 结 和 展 望
1.证明了CAs 能够与Tb 和另一配体形成三重络 合物并发出荧光。 2. 建立了一个新的用稀土荧光探针检测儿茶酚类 化合物的体系，并对实验条件进行了优化。 3. 确定了新方法检测四种物质的线性范围和最低 检出限。
0.2 mmol/L Tb3＋DCTA， 4×10－5 mol/L DOPAC溶液 （色谱纯甲醇：重蒸水＝9： 1），横坐标为5 ml样品中10 mol/L NaOH的体积
表面活性剂的影响


由于水分子对荧光有相当的猝灭作用，体系又 是在水相中，因此尝试加入表面活性剂进行改 进。期望荧光体系能够被包裹在表面活性剂形 成的胶束中得到保护，起到敏化作用。 共尝试加入了阴离子表面活性剂十二烷基磺酸 钠，阳离子表面活性剂溴代十二烷基三甲胺和 非离子表面活性剂 TOPO 。都未起到期望的对 体系的改善作用。

小结： 目前研究最多的体系，适用的pH相对于前两个体系有 了很大提高，但是仍然未能达到文献报道的结果
实验条件的优化

稀土离子与第一配体的选择：
3. Tb3＋ + EDTA体系（2）： Tb:EDTA＝1:1（浓度均为2 mmol/L）, pH＝11, λex＝240 nm，λem＝545 nm,出现递减结果 小结： 在λex＝240 nm，λem＝545 nm,出现的Tb3＋特征波长 处的递减结果，可能是由于在检测条件下 ,Tb －EDTA 体系能发出Tb3＋的特征荧光，而待测物与之形成三重 络合体系后,激发波长红移，亦即三重络合体系的形成 导致了一部分Tb3＋特征荧光的猝灭。

实验操作
向5 ml比色管中依次加入前述Tb-DCTA 溶液0.1 ml、10mo l/L NaOH溶液0.04 ml、10 mol/L CsCl溶液0.05 ml、色谱纯 甲醇4.5 ml，混匀。在检测前再加入待测 物，用重蒸水定容至5 ml，在激发波长 为298 nm，发射波长546.8 nm处用0.5 cm比色池测定荧光强度。
2.三元络合物发光机理(2)
分子内能量转换效率的影响因素：
1. 配体最低的激发三重态（ T1 ）能量高于 Tb 的 5D 能级的能量 4 2.能量转移的速率大于三重态无辐射退激的速率 3.从配体激发单重态向三重态系间窜跃的速率和 几率相当高
2.三元络合物发光机理(3)
儿茶酚胺的磷光发射波长在409 nm－ 417 nm，亦即其三重态（T1）的能量高 于Tb3＋的5D 4能级约3800-4000 cm －1 高量子产率和跃迁几率 能量转移速率常数高达1010s－1 由水或解离的氧导致的配体三重态（T1） 以及Tb3＋， 发光的猝灭也大大减少了。
, 灵敏度高 ，选择性
好
depends
10 –10M-10 –9 M（改良后） 10 –6M-10 –5 M
10-8 M （depends） 10-8 M
分离效果好 ，可结 流动相有可能影响检测 合不同检测器应用 效果
荧光测定法 (THI、EDA) 电化学分析 法
毛细管电泳 （CE）法 稀土荧光探 针法
常规使用，改良后 样品处理程序复杂，特 灵敏度较高 异性不高 能排除抗坏血酸的 灵敏度低,只是针对DA 影响，重现性较好 检测,仍处于实验研究 阶段
分离高效,耗样量少 灵敏度尚不高 简便，可以与各种 灵敏度不够高 分离手段联用
稀土荧光探针检测 儿茶酚类化合物的原理
单纯的 TbCl3 ， Tb-DCTA 体系和 DOPAC 在实验用的波长条件下 (298nm,546.8nm) 都没有荧光信号，可见体系发光是由于 形成了Tb-DCTA－DOPAC三重络合物并 发生了能量转移得结果。
加样顺序影响
Tb＋DCTA， 甲醇， NaOH， CsCl Tb＋DCTA， 甲醇， CsCl， NaOH Tb＋DCTA， NaOH，甲醇， CsCl Tb＋DCTA， NaOH， CsCl，甲醇 Tb，DCTA， 甲醇， NaOH， CsCl DCTA， 甲醇， Tb，NaOH， CsCl

下一步工作：可以与分离技术联用，用于检测 细胞、体液及组织样品中的儿茶酚类物质。
致 谢
赵美萍，常文保，赵金富，程智勇， 石志红，何建涛，裴剑，姚婷婷 等诸位老师和同学在我做毕业论文期间 给我的细致的指导，积极的建议和热情 的帮助。
0.000008
0.000008
CDA/mol·L
CDOPAC/mol·L
a. CDA－ Fluro图
b. CDOPAC- Fluro图
实验结果
B Data1B
250
700
B Linear Fit of Data1_B
800
200
600 500
150
Fluro
Fluro
400 300 200
100

实验条件的优化

稀土离子与第一配体的选择： 1. Eu3＋ + EDTA体系 ； 2. Eu3＋＋phen体系； 小结： 最终弃用这两个体系的原因，是其适用 的pH范围太低，难以使DA的羟基充分解 离形成三元络合物。

实验条件的优化

稀土离子与第一配体的选择：
3. Tb3＋ + EDTA体系（1）： Tb:EDTA＝1:1（浓度均为2 mmol/L）, pH＝11, λex＝300 nm，λem＝545 nm,加入甲醇 （分析纯）、CsCl、TOPO等尝试敏化,无法得到满意 检测限，DA为10－5 mol/L
瑞典神经药理学家Carlsson于1958 年首次提出脑内多巴胺(DA)是独立的 神经递质 正常值范围为血浆：＜888pmol/L； 尿：424-2612nmo1/24h。 增高会引起嗜铬细胞瘤，心肌梗塞， 糖尿病酮症酸中毒等一系列疾病。 而其含量的降低会引起植物神经病 变，帕金森病等。
Epinephrine（E）& nor epinephrine （NE）
Fluro
105 100 95 90 85 80 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
CCS+/M
重原子对于荧光体系 有时也可起到敏化作 用。实验尝试向体系 加入了SrCl2，BaCl2， 以及CsCl，其中CsCl 的加入对体系的荧光 有明显得增强作用 ， 最后选择CsCl浓度为 0.1 mol/L。
甲醇含量影响
450 400 350 300
0.2 mmol/L Tb3＋－DCTA， 4×10－5 mol/L DOPAC溶 液 ，NaOH fixed
Fluro
250 200 150 100 50 0 0 20 40 60 80 100
¼×´ ¼º ¬Á¿£¨ £¥£©
重原子影响
125 120 115 110
50
100
0 0.000000 0.000002 0.000004 0.000006 0.000008
0 0.000000 0.000002 0.000004 0.000006
-1
0.000008
CCA/mol·L
－1
C3,4-二羟基苯 甲 /mol·L 酸
c. C邻二酚－ Fluro图
d. C3，4－二羟基苯甲酸－Fluro图
实验结果
被测物 指标
多巴胺
（DA）
3,4－二羟 邻二酚 3,4－二 基苯乙酸 （儿茶酚）羟基苯甲 （DOPAC） 酸
线性范围 线性相关 系数 检测限
8×10－8 － 8×10－8 － 8×10－8 － 8×10－8 － 8×10－6mol/L 8×10－6mol/L 8×10－6mol/L 8×10－ 6mol/L
பைடு நூலகம்
1.三元络合物的形成
三元络合物体系：

1.离子缔合三元络合物 2.金属离子先后结合两种配体形成三元络合 物
Tb－DCTA－CAs体系：

Tb与DCTA先行络合，然后Tb余下的空位再 与CAs络合，形成三重络合体系
2.三元络合物发光机理(1)
配体受激后,单重态（S1）有三种方式退激：
a. 产生荧光的辐射跃迁(S1-S0) b. 系间窜跃(S1-T1) c. 无辐射跃迁回基态(ISC) 三重态（T 1）也有三种退激方式： a. 产生磷光的辐射跃迁(T1-S0) b. 通过无辐射转移跃迁到 Tb3 ＋ 的激发态 (ET) ， c. 无辐射跃迁回基态(T1～S0)。
DOPAC的荧光图 红：激发波长为279nm
蓝：激发波长为298nm
TbCl3的荧光图
红：激发波长为298nm 蓝：激发波长为240nm
Tb－DCTA荧光图 玫红：激发波长为240nm 绿：激发波长为240nm（三 重络合物，Tb－DCTA浓度 同上） 绿：激发波长为298nm Tb－DCTA－DOPAC 体系荧光图 绿：激发波长为240nm 红：激发波长为279nm 蓝：激发波长为298nm