普洱茶发酵过程中多糖分子量变化研究

刘文君
（云南农业大学食品科学技术学院昆明 650201）
摘要
【研究目的】本文主要通过提取由不同微生物发酵的不同阶段样普洱茶中
的茶多糖，并进行分离纯化以及分子量分析，明确茶多糖在发酵过程中的变化
规律；【方法】采用热水浸提乙醇沉淀法提取普洱茶中的茶多糖，再用双氧水氧
化脱色等对所得到的茶多糖进行分离纯化，用GPC法测定纯化后的茶多糖分子
量；【结果】结果表明，由木霉和酵母发酵的普洱茶中多糖与蛋白质含量均随着
发酵时间的延长而增加。

由木霉发酵的普洱茶中多糖的分子量随着发酵时间的
延长先增大然后减小；由酵母发酵的普洱茶中多糖的分子量未呈现出一定的变
化规律；【结论】茶原料、发酵的微生物种类以及发酵时间等对发酵普洱茶中多
糖与蛋白质含量、分子量都有影响。

关键词：普洱茶；茶多糖；分子量变化；GPC
1 前言
我国是茶树的原产地，又是最早发现茶叶功效，栽培茶树和制成茶叶的国家，自1700多年前我国发现野生大茶树算起，目前已有10个省区198处发现野生大茶树，其中云南省树干直径在一米以上就有十多棵，思茅地区镇源县和平乡千家寨发现野生茶树群落数千亩[1]。

这些已发现的野生大茶树，时间之早，树体之大，数量之多，分布之广，性状之异，可谓世界之最。

叉不仅是世界三大饮料之一，也是人类十大生命营养之一，它的营养不亚于西红柿和草莓，更何况它的医疗功效有着极大的研究价值和开发价值。

研究表明，茶叶中含有600多种化学成分，主要成分是茶多酚、茶多糖、茶单宁、茶色素、咖啡碱、儿茶素等，它们对茶叶的色香味以及营养、保健起着重要作用。

目前已知茶叶对人体具有抗氧化、防衰老、提高免疫性、降血压、降血糖、降血脂、防止心脑血管疾病、抗癌、防龋齿、杀菌、抗风湿性关节炎、抗过敏、防辐射、保护心脏、抗气喘、消食解毒等功效[2]。

为此，茶叶将作为新世纪世界性的健康饮品被广大消费者认可。

普洱茶是云南特有的历史名茶，是以云南思茅、普洱、西双版纳、临沧等地所产的云南大叶种茶优质鲜叶经杀青、揉捻、晒干等工序加工而成的晒青毛茶为原料，经潮水、渥堆、陈化及干燥等工序加工而成的后发酵茶。

其中，渥堆是一道最为关键的工序，为普洱茶独特的品质及保健功效的形成起着重要作用。

普洱茶属于再加工特种茶，是云南独特的茶类产品，具有独特的品质和保健功效。

普洱茶品质的基本特征是：外形色泽褐红，条索肥硕壮实，汤色红浓明亮，独具陈香，滋味醇和、回甘，叶底红褐。

普洱茶可以长期储藏，并在较长的时间内具有时间越长品质越佳及越陈越香特点。

另外，普洱茶还具有经久耐泡的特点。

在1700多年发展历程中，随着社会生产力的不断进步，普洱茶的生产利用方法也不断改进和完善，产品形式多样，有各种散茶及团茶、饼茶、瓜茶、紧茶、砖茶、沱茶、竹筒茶等各种紧压茶，成为中国乃至世界上最为丰富多彩的一类茶叶产品。

普洱茶自古至今一直深受各地消费者的喜爱，究其原因，除了文化方面的因
素之外，普洱茶独特的保健作用是吸引消费者的关键。

它除了具有茶叶的保健功效之外，在降血压、降血脂、减肥、预防心脑血管疾病、防癌、抗癌等方面更具有明显的作用。

法国巴黎安东尼医学系临床教学主任艾米尔.卡罗比医生用普洱沱茶临床试验证明，饮普洱沱茶有减轻人体重、降低人体中类脂化合物、三酸甘油脂和胆固醇的含量的作用[3]。

昆明医学院附一院内科心血管组临床使用普洱沱茶医治高血脂症55例与使用疗效较好的降脂药物安妥明治疗的31例作对比，普洱沱茶的疗效高于安妥明，且无副作用[4]。

广东中山大学，何国藩等用普洱茶研究对人血压、心率及脑血流图的影响表明，饮普洱茶后能引起人的血管舒张，血压暂时下降，心率减慢和脑部血流减少等生理效应，故对老年人的高血压与脑动脉硬化患者，均有良好的作用[5]。

云南昆明天然药物研究所教授梁明达、胡美英等用细胞培养及电子显微镜方法，对普洱茶的抗癌作用进行了10多年的研究，他们发现普洱茶杀癌细胞的作用最为强烈，甚至常人喝茶1％的浓度就有明显的作用。

他们认为，普洱茶具有多种丰富的抗癌微量成分，如β-胡萝卜素，维生素B1、B2、C、E等。

他们的研究还证明，长期饮用普洱茶不仅可以减轻体重，而且能使其胆固醇及甘油三脂减少[6]。

所以长期饮用普洱茶可治疗肥胖症。

另外，普洱茶还具有消炎杀菌、健齿护齿、护胃养胃、抗衰老等保健作用。

茶多糖（TPS）是由糖类、蛋白质、果胶和灰分组成的一种类似灵芝多糖和人参多糖的高分子化合物，其相对分子量为107000。

其中，总糖量约占1/3,蛋白质和果胶约占1/3，灰分、水分及其他成分约占1/3，易溶于热水[7]。

茶多糖具有降血糖、防治糖尿病、降血脂、抗动脉粥样硬化、降血压、抗凝血、抗血栓、防治心血管疾病等作用[8]。

具分离纯化后的茶多糖经紫外吸收图谱表明，茶多糖中存在蛋白质，即茶多糖中的多糖与蛋白质呈紧密结合状态，茶多糖实为一种糖蛋白[9]。

具研究证明，一般随着茶叶原料的老化含量增加[10]。

茶多糖的研究，近年来取得了一些进展，但迄今为止，主要集中在茶多糖的提取方法及其生理作用方面，有关普洱茶多糖在发酵过程中的分子量变化情况及不同发酵批次中的变化还不清楚，为此，本文提出研究普洱茶发酵过程中多糖分
子量变化情况，为云南普洱茶发酵的条件控制提供理论依据。

2 材料与方法
2．1 材料
2．1．1 茶样
普洱茶1—1（原料）、1—3（木霉发酵20天）、1—7（木霉发酵60天）；普洱茶2—3（原料）、2—4（酵母发酵30天）、2—5（酵母发酵40天）。

均由云南农业大学食品科学技术学院食品质量与安全实验室提供。

2．1．2 主要试剂
99%食用乙醇、过氧化氢（天津市化学试剂三厂，分析纯）、氨水（天津市化学试剂三厂，分析纯）、苯酚（天津市化学试剂三厂，分析纯）、浓硫酸（分析纯）、葡聚糖、浓磷酸（天津市瑞金特化学品有限公司，分析纯）、考马斯亮蓝G－250（昆明杰辉生物技术有限公司）。

2．1．3 主要仪器
722s型可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）、HH-2型数显恒温水浴锅（常州市华普达教学仪器有限公司）、旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）、电热恒温鼓风干燥箱（上海中友仪器有限公司）、移液枪、冰箱等。

2．2 试验方法
2．2．1 茶多糖样品的制备工艺
普洱茶样（30g）→乙醇常温浸泡1天→过滤→茶渣→乙醇常温浸泡1天→过滤→茶渣→100ml85℃蒸馏水浸提2h→过滤→滤液Ⅰ→茶渣→100ml85℃蒸馏水浸提2h→过滤→滤液Ⅱ→合并滤液Ⅰ和滤液Ⅱ→旋转蒸发仪浓缩至50ml左右→加三倍体积乙醇沉淀→过滤→收集沉淀→少量蒸馏水溶解→加1/10体积过氧化氢（氨水调pH值8.0）于45℃恒温水浴锅中脱色3h→加三倍体积乙醇沉淀→过滤→收集沉淀→少量蒸馏水溶解→过滤→滤液→加三倍体积乙醇沉淀→过滤→收集沉淀→55℃恒温干燥箱干燥→茶多糖样品
2．2．2 多糖含量的测定[11]（苯酚—硫酸比色法）
（1）标准曲线的绘制：准确称取标准葡聚糖10㎎于250ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4ml，0.6 ml，0.8 ml，1.0 ml，1.2 ml，1.4 ml，1.6 ml
及1.8 ml，各以水补至2.0 ml然后加入6%苯酚1.0 ml及浓硫酸5.0 ml，静止10min，摇匀，室温放置20min后于490nm测定吸光度，以2.0 ml水按同样显色操作为空白，以横坐标为多糖微克数，纵坐标为吸光度，绘制标准曲线，得到多糖含量的计算方程y=0.0066x+0.0068 R2=0.9872(x为多糖含量，y为吸光度)，所得标准曲线如图1所示。

（2）样品中多糖含量的测定：取少量2.1.1所制备的茶多糖样品配制成一定浓度的溶液（0.25mg/ml）,分别吸取1.0ml于试管中，其余操作同标准曲线的绘制，由标准曲线计算出多糖含量。

每个样品重复测定三次，每次做三个平行。

2．2．3 蛋白质含量的测定[12]（考马斯亮兰比色法）
（1）标准曲线的绘制：①标准蛋白液：牛血清蛋白（0.1mg/ml），准确称量牛血清蛋白0.1g，用0.9％的NaCl溶液溶解并稀释至100ml。

②染液：考马斯亮兰G250（0.01％），称量0.1g考马斯亮兰G250溶于50ml的乙醇中，加入100ml 浓磷酸，再加蒸馏水定容到1000ml。

分别取0ml,0.1ml,0.2 ml,0.3ml,0.4 ml,0.5 ml,0.6 ml,0.7 ml,0.8 ml,0.9 ml,1.0 ml于试管中，均用水补足至1.0 ml，各加4 ml考马斯亮兰染液，然后混匀，室温静置3min，以第一管为空白，于波长595nm处比色，以横坐标为蛋白质毫克数，纵坐标为吸光值，绘制标准曲线，得到蛋白质含量的计算方程y=6.09x-0.001 R2=0.996(x为蛋白质含量，y为吸光度)，所得标准曲线如图2所示。

（2）样品中蛋白质含量的测定：取少量2.1.1所制备的茶多糖样品配制成一定浓度的溶液（0.5mg/ml）,分别吸取1ml于试管中，其余操作同标准曲线的绘制，由标准曲线计算出蛋白质含量。

每个样品重复测定三次，每次做三个平行。

2．2．4多糖分子量的测定
分别取少量所制备的茶多糖样品送样至中国科学院成都分院分析测试中心，采用GPC法测定分子量[13]。

3 结果与分析
3.1 木霉发酵普洱茶阶段样中多糖与蛋白质含量变化
分别用苯酚—硫酸比色法，考马斯亮兰比色法测定由原料、木霉发酵20天、木霉发酵60天普洱茶样所制备的茶多糖样品中多糖与蛋白质含量，所得结果见表1。

表1 木霉发酵普洱茶阶段样中多糖与蛋白质含量
茶样
多糖含
量（%）
平均值（%）
蛋白质
含量（%）
平均值（%）
1—1 30.13
30.13±0.37 3.12
2.85±0.31
（原料）29.77 2.52
30.50 2.90
1—3 36.56
36.64±0.24 4.40
4.23±0.16
（发酵20天）37.22 4.20
36.13 4.10
1—7 38.68
38.90±0.24 4.76
4.64±0.16
（发酵60天）39.16 4.70
38.86 4.46
从表1可以看出，由木霉发酵的普洱茶中多糖与蛋白质的含量随着发酵时间的延长均呈增加趋势。

原料的多糖与蛋白质含量最低，经发酵20天的次之，发酵60天的多糖与蛋白质含量均为最高。

3.2酵母发酵普洱茶阶段样中多糖与蛋白质含量变化
表2 酵母发酵普洱茶阶段样中多糖与蛋白质含量
茶样
多糖含
量（%）
平均值（%）
蛋白质
含量（%）
平均值（%）
2—1 40.38
40.78±0.37 5.94
5.60±0.32
（原料）40.86 5.52
41.10 5.32
2—4 43.22
43.20±0.27 7.68
7.92±0.23
（发酵30天）42.92 8.14
43.47 7.94
2—5 50.25
50.17±0.43 15.18
15.18±0.31
（发酵40天）49.71 14.88
50.56 15.50
表2表明，由酵母发酵的普洱茶中多糖与蛋白质的含量也是随着发酵时间的延长而增加的，原料的最低，经发酵30天的次之，发酵40天的多糖与蛋白质含量均为最高。

3.3 木霉发酵普洱茶阶段样中多糖分子量变化
目前多糖的分子量测定方法有GPC法、蒸气渗透压法、溶液渗透压法、超离心法、粘度法、光散射法、还原末端法、聚合度法等多种方法。

由于GPC法具有快速、准确、容易操作等优点，因此目前较为常用。

GPC称为凝胶（渗透色谱）或尺寸排除色谱（SEC）是一种利用多孔填料柱将溶液中的高分子按尺寸大小分离的一种色谱技术。

分子尺寸较大的高分子渗透进入多孔填料孔洞中的几率较小，即保留时间较短而首先淋洗出来；尺寸较小的高分子则容易进入填料孔洞而且滞留时间较长从而较后淋洗出来。

由此得出高分子尺寸大小随保留时间（或保留体积V R）变化的曲线，即分子量分布的色谱图。

色谱图等距分割后，对应每个保留体积V R，i（或V e，i），的色谱峰高度即代表该种分子的浓度（由示差折光或紫外检测仪得出）。

通过色谱图的的归一化，可以求得对应V R，i的i种高聚物重量分数W i，并可利用标准曲线将V R，i换算成分子
Report Method: 凝胶色谱
Printed 20:05:27
2008-4-23
Auto-Scaled Chromatogram
M V
-50.00
0.00
50.00
100.00
150.00
200.00
Minutes
0.00
2.00 4.00 6.008.0010.00
12.00
14.0016.00
4908
dwt/d(logM)Cumulative %
d w t /d (l o g M )
C u m u l a t i v e %
0.00
0.200.40
0.600.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
Slice Log MW
3.00
3.50
4.004.50
5.00
M n =2669
M z =42652
M z +1=91287
M w =11766
M P =4908
MP
Mw
Mn
Polydispersity
4908117662669
4.41
GPC Results
量值M i ,进而得到重均分子量M w 、数均分子量M n 以及分散系数d 。

用GPC 法对原料、木霉发酵20天、木霉发酵60天普洱茶样所制备的茶多糖样品进行分子量分析，所得结果见图3，图4和图5。

图3 原料茶多糖的分子量的GPC 分析
Report Method: 凝胶色谱
Printed 20:05:55
2008-4-23
Auto-Scaled Chromatogram
M V
-50.00
0.00
50.00
100.00
Minutes
0.00
2.00 4.00 6.008.0010.00
12.0014.0016.00
27056
dwt/d(logM)Cumulative %
d w t /d (l o g M )
C u m u l a t i v e %
0.00
0.100.200.300.400.500.60
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
Slice Log MW
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
M n =10448
M z =336852
M z +1=644645
M w =97512
M P =27056
MP
Mw
Mn
Polydispersity
270569751210448
9.33
GPC Results
图4 木霉发酵20天茶多糖的分子量的GPC 分析
Report Method: 凝胶色谱
Printed 20:06:012008-4-23
Auto-Scaled Chromatogram
M V
-50.00
0.00
50.00100.00150.00
200.00Minutes
0.00
2.00 4.00 6.008.0010.0012.0014.0016.00
15145
dwt/d(logM)Cumulative %
d w t /d (l o g M )
C u m u l a t i v e %
0.00
0.100.200.300.400.500.60
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
Slice Log MW
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
M n =8050
M z =192762
M z +1=421202
M w =47704
M P =15145
MP
Mw
Mn
Polydispersity
15145477048050
5.93
GPC Results
图5 木霉发酵60天茶多糖的分子量的GPC 分析
经分析图3，图4，图5得到木霉发酵发酵普洱茶阶段样中多糖分子量的变化情况，见表3。

表3 木霉发酵普洱茶阶段样中多糖分子量的变化
茶样峰位分子
量（Mp）
重均分子
量（Mw）
数均分子
量（Mn）
Z均分子
量（Mz）
分散度
1—1
4908 11766 2669 42652 4.41 （原料）
1—3
27056 97512 10448 336852 9.33 （发酵20天）
1—7
15145 47704 8050 192762 5.93 （发酵60天）
从表3可以看出，由木霉发酵的普洱茶中多糖的峰位分子量（Mp），原料的
最低为4908，经发酵20天增至27056，发酵60天又降至15145；重均分子量（Mw），
原料的最低为11766，经发酵20天增至97512，发酵60天又降至47704；数均
分子量（Mn），原料的最低为2669，经发酵20天增至10448，发酵60天后又降
至8050；Z均分子量（Mz），原料的最低为42652，经发酵20天增至336852，发
酵60天又降至192762；分散度，原料的最低为4.41，经发酵20天增至9.93，
发酵60天又降至5.93。

这说明，由木霉发酵的普洱茶中多糖的峰位分子量、重
均分子量、数均分子量、Z均分子量、分散度，原料的最低，随着发酵时间的延
长均呈现出先增大后减小的变化规律。

3.4 酵母发酵普洱茶阶段样中多糖分子量变化
采用GPC法对原料、酵母发酵30天、酵母发酵40天普洱茶样所制备的茶多
糖样品进行分子量分析，所得结果见图6，图7和图8。

Report Method: 凝胶色谱
Printed 20:06:08
2008-4-23
Auto-Scaled Chromatogram
M V
-50.00
0.00
50.00
100.00
150.00
Minutes
0.00
2.00 4.00 6.008.0010.00
12.00
14.0016.00
1541
dwt/d(logM)Cumulative %
d w t /d (l o g M )
C u m u l a t i v e %
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
Slice Log MW
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
M n =6308
M z =483801
M z +1=1068131
M w =104347
M P =1541
MP
Mw
Mn
Polydispersity
15411043476308
16.54
GPC Results
图6 原料茶多糖的分子量的GPC 分析
Report Method: 凝胶色谱Printed 20:06:152008-4-23
Auto-Scaled Chromatogram
M V
-50.00
0.00
50.00
100.00
150.00
Minutes
0.00
2.00 4.00 6.008.0010.00
12.00
14.0016.00
9084
dwt/d(logM)Cumulative %
d w t /d (l o g M )
C u m u l a t i v e %
0.00
0.100.200.300.400.500.600.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
Slice Log MW
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
M n =5024
M z =184428
M z +1=369027
M w =40970
M P =9084
MP
Mw
Mn
Polydispersity
9084409705024
8.16GPC Results
图7 酵母发酵30天茶多糖的分子量的GPC 分析
Report Method: 凝胶色谱
Printed 20:06:222008-4-23
Auto-Scaled Chromatogram
M V
-50.00
0.00
50.00
100.00
150.00
Minutes
0.00
2.00 4.00 6.008.0010.00
12.00
14.0016.00
3194
dwt/d(logM)
Cumulative %
d w t /d (l o g M )
C u m u l a t i v e %
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
Slice Log MW
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
M n =3447M z =223762
M z +1=542458
M w =37333
M P =3194
MP
Mw
Mn
Polydispersity
3194373333447
10.83GPC Results
图8 酵母发酵40天茶多糖的分子量的GPC 分析
分析图6，图7，图8得到酵母发酵普洱茶阶段样中多糖分子量的变化情况，见表4。

表4 酵母发酵普洱茶阶段样中多糖分子量的变化
茶样 峰位分子量（Mp ） 重均分子量（Mw ） 数均分子量（Mn ） Z 均分子
量（Mz ） 分散度
2—1
1541 104347 6308 483801 16.54 （原料） 2—4 9084 40970 5024 184428 8.16 （发酵30天）
2—5 3194
37333
3447
223762
10.83
（发酵40天）
从表4可以看出，由酵母发酵的普洱茶中多糖的峰位分子量（Mp），原料的最低为1541，经发酵30天增至9084，发酵40天又降至3194；重均分子量（Mw），原料的最高为104347，经发酵30的次之为40970，发酵40天的最低为37333；数均分子量（Mn），原料的最高为6308，经发酵30天的次之为5024，发酵40天的最低为3447；Z均分子量（Mz）,原料的最高为483801，经发酵30天降至184428，发酵40天又增至223762；分散度原料的最低为16.54，经发酵30天降至8.16，发酵40天又增至10.83。

这表明，由酵母发酵的普洱茶中多糖的峰位分子量，随着发酵时间的延长先增大然后减小；重均分子量与数均分子量，随着发酵时间的延长而逐渐减小；Z均分子量与分散度，随着发酵时间的延长先减小然后增大。

4 讨论
4．1影响发酵普洱茶中多糖及蛋白质含量的因素
发酵是普洱茶制作过程中的一道必不可少的工序，是形成普洱茶品质特征的关键。

本研究表明，由木霉与酵母发酵的普洱茶中多糖与蛋白质的含量均随着发酵时间的延长而增加。

这可能是普洱茶在发酵过程中纤维素、淀粉、果胶等非水溶性碳水化合物，在微生物、酶等作用下被分解为水溶性的多糖，从而使多糖的含量得到提高[14]。

这对普洱茶品质特征的提高是很有利的。

另外，茶原料以及发酵的微生物种类等对发酵普洱茶中多糖及蛋白质含量都有一定的影响。

同时，本研究还进一步证实了茶多糖是一种与蛋白质紧密结合在一起的水溶性酸性糖蛋白，其中的蛋白质并非杂质，可能与其活性有直接的关系[15]。

4．2 影响发酵普洱茶中多糖分子量的因素
本研究表面，由木霉发酵的普洱茶中多糖的峰位分子量、重均分子量、数均分子量、Z均分子量以及分散度，随着发酵时间的延长均呈现出先增大后减小的变化规律。

而由酵母发酵的普洱茶中多糖的峰位分子量、重均分子量、数均分子量、Z均分子量以及分散度等未呈现出一定的变化规律。

出现这种差异的原因，一方面可能与发酵的时间不一致有关，另一方面可能与茶原料以及发酵的微生物不同有关。

4．2 本研究需要说明的问题
由于受到各种条件的限制，本研究仅对由木霉和酵母两种微生物发酵的有限几个批次的普洱茶中的多糖作了分析研究，至于由其它微生物发酵的普洱茶以及各发酵批次的普洱茶中多糖的变化规律，还需作更进一步的研究。

5 结论
5．1由木霉和酵母发酵的普洱茶中多糖与蛋白质的含量均随着发酵时间的延长而增加。

5．2 由木霉发酵的普洱茶中多糖的分子量，随着发酵时间的延长先增大然后减小；由酵母发酵的普洱茶中多糖的分子量未呈现出一定的变化规律。

5．3 茶原料、发酵的微生物种类以及发酵时间等对发酵普洱茶中多糖与蛋白质含量、分子量都有影响。

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致谢：首先，要感谢的是导师龚加顺教授。

本论文是在导师的悉心指导下才得以完成的，从开始实验到论文写作，然后修改和定稿，无处不渗透着导师辛勤的汗水。

导师广博的学识，正直的品格，以及严谨治学的态度深深地影响着我，使我受益匪浅。

在此，向导师致以我衷心的感谢和崇高的敬意！
其次，要感谢的是食品质量与安全实验室在我完成实验的过程中曾经帮助过我的师兄师姐们，在他们的帮助和指导下我的实验才得以顺利完成。

最后，还要向参加本次论文答辩的老师和专家们表示衷心的感谢！。