双转基因阿尔茨海默病模型

文献标识码 : A
Genetype iden tif ica tion and h istolog ic ana lysis of PS1 /APP double tran sgen ic A lzhe i2
m er d isea se m ouse m odel
SONGM in1 , TAN G Jun2 , L I Da2bing2 , XU Hai2wei2 , BA I Yun1 (1Department of Molecular Genetics, 2Department of Physiolo2
1 材料与方法
1. 1 实验动物
美 国 国 立 Jackson 动 物 中 心 提 供 B6C32Tg ( APPswe, PSEN1de9) 85Dbo /J品系双转基因小鼠杂合体种鼠 2 只 ,繁殖 所产生后代 6只 , 9～12月龄 ,分笼喂养于光照 /黑暗为 12 h /12 h 的恒温环境 ,每笼 2只 ,自由摄食和饮水 。
mental animal model. Key words: A lzheim er disease; transgenic mouse; senile p laque
阿尔茨海默病 (A lzheimer disease, AD )作为一种 病因尚未完全明了的神经退行性疾病 ,其发病机制的 研究一直是神经科学研究的热点 。目前 , Aβ炎性假 说 [ 1 ]因其能够较好的符合病理学 、实验以及临床流行 病学研究结果而受到越来越多研究者的承认 。 该学说认为 : Aβ (β2amyloid) 42 肽在脑内的异常
1. 2 主要试剂
小鼠血液基因组 DNA提取试剂盒购自上海生工 , Taq酶购 自大连宝生物工程公司 ;小鼠抗人 Aβ抗体 ( Sigma) 、大鼠抗小 鼠 MHCⅡ I2A / I2E (BD ) 、山羊抗小鼠 GFAP多抗 , HRP标记的 山羊抗小鼠 IgG、HRP标记山羊抗大鼠 、生物素标记兔抗山羊 多克隆抗体 (相应三抗为 HRP标记链霉素 )等及 DAB 显色试 剂盒购自北京中山生物公司 。
论著
PS1 /APP双转基因阿尔茨海默病模型传代小鼠的基因型鉴定及其组织学分析
宋 敏 1 ,唐 军 2 ,李达兵 2 , 徐海伟 2 , 白 云 1 (第三军医大学基础医学部 : 1医学遗传学教研室 , 2生理学教研室 , 重庆
400038)
提 要 : 目的 对所获的 PS1 /APP双转基因阿尔茨海默病 (A lzheimer disease, AD )模型小鼠进行基因鉴定 ,进一步
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第 三 军 医 大 学 学 报 第 28卷
型 。如侧脑室直接注射 Aβ多肽以及 APOE、早老素 21 ( p resenilin 1, PS21 ) 、β2淀 粉样 前体 蛋白 (β2am yloid p recursor p rotein,β2APP )转基因动物模型 等 [ 3 ] ,但是 由于 Aβ42肽分泌增多是由于多基因突变导致 ,因此研 究者们开始构建两基因甚至三基因突变的小鼠模型 , 研究证明转基因动物相对能够比较好的模拟 AD 病的 病理学变化 [ 4 ] 。为此 ,我们从 Jackson 实验室购入了 APPswe / PS1双转基因小鼠杂合体种鼠 2只进行繁殖 , 由于种鼠为杂合体 ,根据遗传规律所获后代有 1 /4 的 几率为阴性纯合子 ,所以在使用前必须进行基因型检 测 。而后 ,我们以阴性纯合子 (野生型 )为对照 ,对所 获的阳性的 PS1 /APP双转基因阿尔茨海默病模型小 鼠进一步进行用刚果红组织学染色结合免疫组织化学 染色 ,检测老年斑 ( senile p laque, SP)的形成情况 ,特 别是小胶质细胞和星型胶质细胞的活化 ,探讨我们所 获模型的应用价值 。
第 28卷第 14期 2006年 7月
ACTA
第 三 军 医 大 学 学 报 ACADEM IAE M ED IC INAE M IL ITAR IS TERT
IA
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Vol. 28, No. Jul. 2006
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文章编号 : 100025404 (2006) 1421453204
tures, the activated m icroglia and astrocyte surrounded the p laque, thus the classic senile p laque stucture was formed. Co nc lu s io n The double transgenic PS1 /APP mouse p roduced by the two m ice we bought from Ameri2 can Jackson Laboratory could simulate the specific pathogenesis of A lzheim er disease and be the efficient experi2
的小胶质细胞和星形胶质细胞处于活化状态 ,形成典型的 SP结构 。结论 我们获得的 PS1 /APP双转基因小鼠能够模拟
AD患者脑内的主要病理过程 ,提供有效的实验动物模型 。
关键词 : 阿尔茨海默病 ;转基因小鼠 ;老年斑
中图法分类号 : R394233; R394. 2; R749. 16
1. 4 PS1 /APP转基因小鼠脑组织的病理学及免疫组 织化学分析
用戊巴比妥钠 100 mg/ kg将动物深度麻醉 ,开胸从左心室
插管 至 升 主 动 脉 , 先 灌 注 生 理 盐 水 100 m l, 随 后 灌 注 由 0. 1 mol/L PBS配制的 40 g/L 多聚甲醛 100 m l。取脑后固定 , 脱水 。待脑沉底后用冰冻切片机切片 ,厚为 40 μm。将包含齿 状回和海马的所有切片按顺序收集于盛有抗冻缓冲液的 12孔 培养板中 ,每隔 5张切片取 1 张切片 ,每只小鼠可得 5 套部位 相同或相近 、每套包含海马和齿状回的 12 张切片 。分别用于 刚果红组织学染色 、Aβ、MHC2Ⅱ、GFAP 免 疫 组 织化 学 染 色 。 刚果红染色程序 :切片贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上自然干 燥 , 苏木精染色 5～10 m in ,冲洗 , 1 %盐酸乙醇分化数秒钟 ,温 水显蓝 ,冲洗 ;甲醇刚果红染色 15 m in ,冲洗 ; 0. 12 %碱性乙醇 分化数秒钟 ,冲洗后常规脱水 、透明 、封片 。免疫组化染色程 序 :采用漂片法 :小鼠抗人 Aβ抗体 ( 1 /1 000)显示 Aβ斑块 ,大 鼠抗小鼠 MHC2Ⅱ (1 /400)染色显示活化小胶质细胞 ,山羊抗小 鼠 GFAP多克隆抗体 (1 /400)显示星型胶质细胞 , 37 ℃孵育 2 h 后 4 ℃过夜 ,二抗分别为 HRP标记大鼠抗小鼠 , HRP标记山羊 抗大鼠 ,生物素标记兔抗山羊多克隆抗体 (三抗为 HRP标记链 霉素 ) , 37 ℃孵育 2 h后 ,漂洗 , DAB 显色 。常规贴片 ,脱水 、透 明封片 。O lympus显微镜观察 ,摄片 。
对其进行组织学分析 ,检测老年斑 ( senile p laque, SP)的形成情况 。方法 设计特定的引物 , PCR扩增转入基因组 DNA 中
的 APP基因 ,对转入 PS1 /APP的小鼠应用刚果红染色结合免疫组化观察 Aβ沉积 、小胶质细胞和星型胶质细胞的活化 。
结果 与未转入的阴性对照相比 ,在 PS1 /APP双转基因的 AD 小鼠皮质和海马内可见 Aβ斑块形成 ,围绕在 Aβ斑块周围
1. 3 PS1 /APP转基因小鼠基因型鉴定
抽取小鼠尾血 30μl,加入 70μl EDTA 2二钠抗凝剂 。参照 小鼠血液基因组 DNA 试剂盒所提供方法提取基因组 DNA ,紫 外分光光度计和电泳鉴定后 ,根据 Jackson动物中心设计合成 引物 序 列 , 扩 增 APP, 上 游 5′2GACTGACCACTCGACCAGGT2 TCTG23′, 下 游 5′2CTTGTAAGTTGGATTCTCATATCCG23′, 其 产 物大小为 350 bp。阳性对照为 β2actin,上游 5′2GCTACAGCT2 TCACCACCACAG23′, 下 游 5′2GGTCTTTACGGATGTCAACGTC2 3′,扩增产物 232 bp。反应总体系为 25 μl: 10 ×buffer 2. 5 μl, ddH2O 9. 5μl, dNTP 5μl, M gCl2 1. 5μl,引物各 0. 5μl,基因组 DNA 5μl, 94 ℃预变性 5 m in后加入 Taq DNA 聚合酶 1 μl, 94 ℃ 60 s, 56 ℃ 60 s, 72 ℃ 60 s,循环 35次 。完毕后电泳分 析。
基金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 海 外 青 年 学 者 合 作 研 究 基 金 资 助 项 目 ( 30228018 )
Supported by the N ational N atural Science Foundation of China2Joint Research Fund for O verseas Chinese Young Scholars (30228018)
沉积是 AD 致病的关键和始动因素 。Aβ42肽由淀粉样 蛋白跨膜前体蛋白 ( amyloid p recursor p rotein, APP)经 过内源性分泌酶裂解后的跨膜区和胞外区片段组成 。 在正常情况下 , APP裂解后大部分是纤维原性较低 、不 易聚集的 Aβ40肽 ,只有 5% ～10%是较长的 、纤维原性 较高的 Aβ42肽 , 并通过正常的生理机制降解 。而在 AD 患者 中 , 由 于 基 因 突 变 或 者 清 除 机 制 障 碍 导 致 Aβ42增多 ,其在体外彼此通过高度的疏水作用而聚合 成寡聚体 ,进而形成纤丝沉积直至形成较致密的斑块 , 从而导致氧化应激 、破坏离子平衡 、激活补体系统 、活 化小胶质细胞和星型胶质细胞等途径导致引发一系列 的病理学变化和相应的临床表现 [ 2 ] 。 针对 Aβ炎性假说 ,目前构建了多种实验动物模
作者简介 :宋 敏 (1979 - ) ,男 ,江西省九江市人 ,博士研究生 ,助教 ,主要从 事神经免疫方面的研究 。电话 : (023) 68753925源自文库
通讯作者 :白 云 ,电话 : (023) 68752258, E2m ail: geneby@ yahoo. com. cn 收稿日期 : 2005206229;修回日期 : 2005209218
gy, College of M edicine, Third M ilitary M edical University, Chongqing 400038, China)
Abstract: O b je c tive To identify the genetype of the PS1 /APP double transgenic mouse model, analyse the tissue histology and detect the form ation of the senile p laque. M e tho d s The specific p rimer was designed and the APP gene was amp lified by PCR from the mouse genome DNA. The Aβ deposits, activation of m icroglia and astrocyte were observed by the congo red staining and immunohistologic methods. R e su lts A s compared to the negative control, the PS1 /APP mouse disp layed Aβ deposits restricted to cortical and hippocampal struc2