脂肪酶综述

刘春雷等对lipase LVK纯酶进行固定化，通过对不同吸附时 间、固定化载体与酶用量、pH、温度、戊二醛交联的最适条 件的研究获得最佳工艺条件：温度35℃、pH710、吸附时间 3h、载体与酶的用量比9∶1、戊二醛浓度0112mol /L、交联 时间2h,交联温度9℃。得到的吸附-交联固定化脂肪酶酶活为 (63118U / g) ,酶活回收率为6214% ,半衰期大于15d。
脂肪酶研究概况
生物科学与工程学院
王广庆 陈增
2009年10月
概述 脂肪酶的来源 产脂肪酶微生物的筛选 脂肪酶的生产 脂肪酶酶活性 脂肪酶催化性能改良 固定化脂肪酶 脂肪酶应用
Pseudomonas aeruginosa 脂肪酶X2衍射三维结构图
假丝酵母脂肪酶B 假丝酵母脂肪酶
一、脂肪酶的概述
分光光度法
微乳液中水滴的大小远小于乳化液中的油滴, 因此, 微乳液体 系的界面积要比乳化液大得多, 这有利于界面激活脂肪酶发 挥其催化作用。 原理与方法 张海燕等研究适合于微乳液体系中脂肪酶酶活测定的分光光 度法, 即以吐温一为表面活性剂, 正己烷为有机溶剂, 三油酸 甘油醋为底物, 旋转蒸发器十真空泵为反应设备的测试方法。 这种方法具有成本低, 灵敏, 重复性好等优点, 可作为脂肪酶 活性测定的一个可靠方法。它是基于脂肪酸与铜离子形成铜 它是基于脂肪酸与铜离子形成铜 经苯萃取后进行比色测定（ 皂, 经苯萃取后进行比色测定（铜皂在附近有一宽的吸收 ）。该测定方法还有待于进一步推广。 峰）。
五、脂肪酶催化性能的改良
从催化特性来看, 脂肪酶的另一显著特点是它只能在异相系 统(即油- 水界面) 或有机相中作用。在水相中,脂肪酶通常催 化水解反应的进行,而在有机相中,它却能催化各种合成反应: 如酯化、酯的醇解、酯的氨解和酯的酸解等。然而有机溶剂 会使酶变性或使酶活力下降,因此寻找耐有机溶剂 耐有机溶剂的脂肪酶, 耐有机溶剂 使其在有机溶剂或含有机溶剂的环境中具有较高的催化活性, 已成为脂肪酶研究领域的一个重要方向。
七、脂肪酶的固定化
脂肪酶是水溶性的,不易回收重复使用,粉末状脂肪酶分散于 有机溶剂中容易失活,酶的固定化有利于酶的分散、回收和再 利用，减少酶的损耗和残余酶产生的再次污染。脂肪酶的固 定化有多种方法，常用的固定脂肪酶的方法有：吸附法、包 埋法及化学键合法。
树脂吸附法wenku.baidu.com
树脂吸附法是70 年代逐渐发展起来的一项新技术。大孔树 脂是一类有机高聚物吸附剂，在化学结构上,它与离子交换树 脂相似，不同之处在于不引入可进行离子交换的酸性或碱性 基团，它的吸附作用是通过表面吸附、表面电性或形成氢键 等达到的，具有选择性好,吸附容量大，机械强度高，再生处 理方便，吸附速度快，解析容易等优点，而且这种高度交联、 具有三维网状结构的高分子聚合物不溶于一般溶剂，在常温 下十分稳定,使用过程中不会有任何物质释放出来，至于生产 过程中残留的某些杂质可在使用前彻底清洗出来。
序列筛选途径 以脂肪酶三联体活性中心(Ser-Asp-His)和氧阴离子 (oxyanion hole)区的保守序列设计引物，以环境基因组DNA 为模板，扩增脂肪酶基因片段，然后用基因组步查 (genomic-walking)的方法克隆出全长脂肪酶基因。 Bell 等用基于序列筛选途径从新西兰Kairua Park 温泉环境 基因组中克隆到一种新脂肪酶基因，并在异源宿主大肠杆菌 中实现表达。
原理
以X- 5大孔树脂和戊二醛对脂肪酶进行吸附-交联固定化,一 方面,利用树脂的孔隙吸附脂肪酶,可使酶的活性中心更裸露, 提高酶的催化活性;另一方面,利用戊二醛交联可以使酶分子 与载体分子通过多点交联,使吸附-交联固定化脂肪酶空间构 象产生“刚性”,受热时吸附-交联固定化脂肪酶分子不易伸 展打开从而能维持其构象稳定,提高热稳定性。
八、脂肪酶的应用
脂肪酶在食品中的应用 医药中的应用 洗涤剂中的应用 皮革中的应用 脂肪酶在饲料中的应用 造纸工业中作用 催化合成生物柴油
谢谢
为了获得高效非水相脂肪酶，选择适当两亲性的表面活性剂 或底物类似物作为印迹分子，待印迹分子与酶充分印迹接触 后，将印迹分子-酶复合物冷冻干燥，用非水溶剂洗脱印迹 分子，形成了活性中心开启的印迹酶，并且这种状态在有机 溶剂的刚性环境里仍能维持。 Fishman等用一系列脂肪酸和表面活性剂Tween 20 作为印 迹分子，制备有机相生物印迹脂肪酶，在非水相介质中催化 水解己酸甲酯反应。
真菌脂肪酶 真菌脂肪酶具有温度和pH 稳定性、底物特异性以及在有机溶 剂中具有高活性，且提取成本比较低等优点，因而发展迅速。 商业化的真菌脂肪酶主要有: 黑曲霉( Aspergillus- niger) , 米 曲霉( Thermomyces Lanuginosus)等。
三、产脂肪酶微生物的筛选
脂质体包埋脂肪酶 双亲分子共价或非共价修饰酶分子表面，可以增加酶表面的 疏水性，使酶均一地溶于有机溶剂，提高酶的催化效率。增 加水溶性脂肪酶在疏水性有机介质中的溶解性可显著提高脂 肪酶的催化效率。通过混合脂肪酶和脂溶液，收集并冷冻干 燥所得沉淀即得脂质体包埋脂肪酶 。
六、脂肪酶的活力测定方法
经典方法:橄榄油乳化法 经典方法 橄榄油乳化法 缺点： 缺点 制备麻烦需用超声波装置等, 且不稳定易分层。 由于超声条件的差异, 常常造成乳液液滴大小不均, 实验重复 性不好。 乳状液体系是不透明的, 不适合于用光学手段对底物或产物 进行测定。 而且由于该体系中含有缓冲液,这种定量分析方法耗碱体积小 及指示剂终点变色不明显也造成该滴定方法不准确、不灵敏。
生物印迹脂肪酶 生物印迹是一种通过酶与配体间的相互作用、诱导,从而改变 生物印迹 酶的构象的方法,修饰过的酶与配体间的结合能力有一定程度 的提高。 原理 根据酶在有机溶剂中具有“刚性”结构的特点，利用酶与印 迹分子的相互作用，诱导、改变酶的构象，制备具有结合该 印迹分子及其类似物能力的“新酶”，是修饰改造酶的一种 方法。水溶性脂肪酶在通常状况下，活性位点被 “盖子” 结构覆盖，呈非活性状态。当底物及其类似物介导的油水界 面产生时，盖子打开，呈活性状态。
可养微生物脂肪酶高产菌筛选 通常采用含甘油三酯琼脂平板法 并通过在培养基中添加指 琼脂平板法, 琼脂平板法 示剂如罗丹明B、溴甲酚紫、维多亚蓝等作为筛选标记。 施巧琴( 1981) 采用脂肪酶水解脂肪后产生的脂肪酸与维多 ( 利亚蓝反应呈蓝绿色透明圈平板法筛选出产碱性脂肪酶的扩 展青霉。
不可养微生物脂肪酶产生菌的筛选 宏基因组(metagenome)技术绕过纯培养步骤，直接从生境 宏基因组 样品中获取遗传信息，提供更加全面的基因资源，从而有效 地提高了新酶的筛选效率。采用宏基因组技术筛选脂肪酶有 两种途径- 功能筛选和序列筛选。 功能筛选途径 即把来源于不可培养微生物的DNA 克隆到大肠杆菌质粒中， 构建宏基因组文库，然后基于脂肪酶活性筛选获得微生物脂 肪酶基因。
发酵培养基 由碳源、氮源诱导物及常见的无机盐等组成 。 速效碳源 如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等有利于细菌脂肪酶的 形成，而缓效碳源如玉米粉和小麦粉等则有利于真菌脂肪酶 的形成。 一般认为复合氮源 复合氮源对微生物生长及产酶效果较好。有机氮源 复合氮源 一般比无机氮源要好。 钙离子和镁离子能促进脂肪酶的分泌 。 大多数微生物只有诱导物 诱导物存在时才能产生脂肪酶。诱导物可 诱导物 以是甘油三酯、长链脂肪酸、脂肪酸酯及其表面活性剂。许 多研究表明培养基中添加表面活性剂如Tween 80、Triton X100、SDS、PEG 和阿拉伯胶等可以不同程度地提高脂肪酶 的产量。
嗜热芽孢杆菌脂肪酶
脂肪酶的特性 位置专一性 是指酶对底物甘油三酯Sn- 1( 或3) 和Sn- 2 酯键的识别和水 解。 立体专一性 一般是指酶对底物甘油三酯中立体对应结构的1 位和3 位酯 键识别和选择性水解。如猪胰脂肪酶水解甘油三酯时没有1 和3 位立体选择性; 人奶和牛奶中脂蛋白脂肪酶优先水解1 位 酯键。
脂肪酶( triacylglycerol lipase EC3.1.1.3) 广泛的存在于动 植物和微生物, 它可将脂肪分解成甘油和脂肪酸, 是一类特 殊的酯键水解酶。 脂肪酶的结构特点 同源区段: His- X-Y-Gly-Z- Ser-W- Gly 或Y-Gly- His- SerW-Gly (X、Y、W、Z 是可变的氨基酸残基) ; 活性中心是丝氨酸残基, 正常情况下受1 个α- 螺旋盖保护。
二、脂肪酶的来源
脂肪酶广泛存在动物、植物和微生物中而微生物脂肪酶种类 最多, 广泛存在于细菌、酵母和霉菌中, 最易获得和大规模生 产, 且具有比动植物脂肪酶更广的pH、温度适应性, 因此是 工业用脂肪酶的重要来源。 细菌脂肪酶 细菌脂肪酶大多数是胞外酶易于液体深层发酵, 生产比较容 易。细菌脂肪酶大多数是碱性脂肪酶, 且在pH4~11、温度 30℃~60℃间具有良好的稳定性。假单胞菌属的细菌脂肪酶 应用最为广泛。
四、脂肪酶的生产
培养基及发酵条件优化 影响发酵过程的因素 ： 培养基组成、接种量、种龄、培养温度、转速、装液量、发 酵周期、溶氧、pH 值和通气条件。 条件优化 ： 单因子法、正交设计法
培养方式与发酵调控 采用液体深层培养法生产 ，补料分批发酵 。 补料优化策略 ： 通常以基质的补料速率为主控制量, 溶氧、pH、细胞浓 度 ( x) 、底物浓度( s) 、比生长速率( µ) 、摄氧( OUR) 、氧传 递速率( OTR) 、CO2 生成速率( CER) 和呼吸商( RQ) 等变 量为辅助控制量,求取优化控制使得发酵终止时产物产量最高。