新基因功能研究的策略与方法精讲

拟南芥中鉴定到一个F-box 蛋白——AtPP2-B11，在延 长盐处理时间时，其转录 水平和蛋白水平均出现显 著诱导表达。过表达 AtPP2-B11的转基因拟南芥 表现出明显的高盐耐受性， 而相应的RNA干扰株比野 生株对盐胁迫更敏感。 iTRAQ定量分析显示，在盐 胁迫下有4311个差异表达 蛋白受到AtPP2-B11调控。
• 基因过表达细胞模型
• 基因沉默细胞模型
基因来自百度文库表达细胞模型
•定义：通过载体将目的基因转入某一特定细 胞中，使其过表达，观察该细胞生物学行为 的变化，从而了解该基因的功能。 •应用：1）化学法 细胞感染 2）物理法 电穿孔法，效率高 3）生物法 应用病毒基因载体进行 转基因，复制产生病毒蛋白导致机体免疫反 应，从而影响目的基因表达。
（或碱基）打分求和的结果，一般来说，匹配片段越长、 相似性越高则 Score值越大。
E value:随机匹配的可能性
Identities:匹配上的碱基数占查询到的序列长度的百分比
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DNA序列的开放阅读框查找
预测其编码蛋白质的氨基酸序列 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/
细胞内表达的长dsRNA或外源性长dsRNA在 Dicer酶的作用下降解成小RNA；小RNA的双链解 开，其中一条链被优先装载入RNA诱导沉默复合 物（RISC）中； 装载了小RNA的RISC复合物就会在 细胞内积极地“搜索”转录组，探寻潜在的RNA 靶分子；被装载入RISC复合物当中的向导链-ssRNA随后引导RISC复合物当中的核酸内切酶 （Argonaute蛋白）反复剪切拥有向导链同源序列 的mRNA靶分子。
新基因功能研究的策略与方法
目 录
• 生物信息学预测
• 研究基因的时空表达模式 • 细胞及动物水平验证
生物信息学预测
• 序列相似性分析
• DNA序列的开放阅读框查找 • 蛋白质理化性质分析
序列相似性分析
相似性(similarity)： 是指一种很直接的数量关系 同源性(homology)： 指从一些数据中推断出的两个基因或蛋白质 序列具而共同祖先的结论，属于质的判断 序列间的相似性越高，是同源序列可能性就 更高
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• 限制性核酸内切酶切位点
• 外显子、内含子剪切位点分析
蛋白质的理化性质分析
氨基酸组成、分子质量、预测等电点、疏水性、 亲水性、极性、电荷分布等基本理化特性
web.expasy.org/protparam
疏水性分析
ExPASy的ProtScale程序
http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl
研究基因的时空表达模式
基因表达的时空性是指基因的表达在个体 发育的不同阶段以及在个体的不同组织和细 胞类型中均不相同，是有机体发育、分化、 衰老等生命现象的分子基础。 基因表达的时空性特征为基因功能的研究 提供了重要的信息：如果基因在某一特定的 正常组织细胞中的表达水平较高，则往往表 示其在维持正常生理状态中发挥着重要的作 用；而如果基因在相应的病态组织细胞中表 达异常，则提示其可能与该病理过程的发生、 发展有关。
蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等为疏水性氨基
酸，对蛋白质的三级结构有重要影响 可用来计算蛋白质的疏水性图谱
蛋白跨膜结构分析 www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM 信号肽预测与识别 www.cbs.dtu.dk/services/signalP 蛋白质卷曲螺旋预测 www.ch.embnet.org/software/COLIS_form.ht ml • 磷酸化位点预测与识别 • www.phosphosite.org • • • • • •
是指人工合成能与DNA或RNA互补结合的 特异性寡核苷酸链，使其专一性地抑制基因 表达，以达到调控表达基因的目的。ASON 一般设计在编码区或3’非编码区，长度以 15~20nt较为合适。ASON包括反义DNA和反 义RNA。
RNAi技术
• 通过人为地引入与靶基因具有同源序列的 dsRNA，诱导靶基因的mRNA降解，从而达 到阻止基因表达、产生“功能失活”的目 的。 • 优势（与ASON比较）：操作简单、投入少、 周期短；用于研究特定基因在特定组织细 胞的特定发育阶段中的功能。
研究基因的时空表达模式
• mRNA水平的表达谱分析
• 蛋白水平的表达谱分析
mRNA水平的表达谱分析
• Northern Blotting
• 原位杂交 • RT-PCR • cDNA微阵列
蛋白水平的表达谱分析
• Western Bloting
• 免疫组化技术 • 双向凝胶电泳 • 生物质谱技术
细胞及动物水平验证
基因沉默细胞模型
• 原理：采用反义核酸分子抑制、封闭或破
坏靶基因组 • 反义寡核苷酸、核酶及RNA干扰
基因沉默在人细胞作用模式
• 第一种为RNA-RNA 模 型其主要特征是RNA 引导链与RNAPII 合成 的低拷贝转录子结合, 从而导致沉默。 • 第二种为RNA-DNA 模 型其主要特征是在转 录过程中, RNA 引导链 与靶标的一条DNA 形 成二聚体, 从而导致沉 默。
核苷酸序列相似性分析 BLASTn 用查询序列逐一搜索核酸数据库中的 序列
序列决定结构，结构决定功能
氨基酸序列相似性分析 BLASTx 核酸序列翻译成蛋白质之后逐一搜索 蛋白质数据库中的序列
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST
Score：使用打分矩阵对匹配的片段进行打分，这是对各对氨基酸残基
反义技术
•原理：指通过碱基互补配对原理，利用人工 或生物合成的特异互补性DNA或RNA片段（或 其修饰产物），干扰基因的解旋、复制、转 录、mRNA剪接加工与输出、翻译等各个环节， 抑制或封闭靶基因的表达，从而调节细胞的 生长分化等。 •分类：反义寡核苷酸技术（ASON） 核酶技术 小干扰RNA
ASON技术（反义寡核苷酸技术）