首批国家醋酸奥曲肽对照品的研制
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基质辅 助 激 光 解 析 飞 行 时 间 质 谱 仪 ( 岛 津 CFR plus) , Waters 251 高效液相色谱仪 (美国) , 万通 KF756 水分测定仪 (瑞士) 。 11 2 试剂
醋酸奥曲肽 (厂 A , 批号 040315 , 厂 B , 批号 041210 , 厂 C , 批号 E08046) , 醋酸奥曲肽对照品
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中国药事 2007 年第 21 卷第 10 期
μL21 的溶液 , 取 10μL , 加入 45 mmol ·L21 二巯基 苏糖醇溶液 5 μL , 50 ℃加热 15 min , 作为还原奥 曲肽供试品溶液 [1] 。
21 2 氨基酸组成分析 按照相关文献方法测定[223 ] 。
21 3 纯度分析 反相色谱法 , 流动相 A 为乙腈21 mol ·L21 四
21 8 氨基酸序列 委托北京大学生命科学院测定 。
21 9 红外光谱 委托本所仪器分析室测定 。
3 结果与讨论 31 1 原料分析与待标品制备
采用面积归一化计算 , A 、B 和 C 3 个厂家的 奥曲肽的纯度分别为 1001 0 % , 991 5 %和 991 6 %。 表明 3 个样品纯度均符合要求 。水分含量分别为 51 1 % , 21 3 % , 和 41 3 % , 比旋度分别为2441 2°、2 451 4°和2441 0°, 均符合要求 。考虑到水分含量 , 最 后选用厂家 C 的样品作为首批国家醋酸奥曲肽对 照品原料 , 并按要求进行分装制备待标品 。 31 2 结构确证
反相色谱法 , 流动相 A 为 p H = 31 0 的磷酸溶 液 。流动相 B 为甲醇 , 检测波长 210 nm , 进样体 积 20 μL , 流速 11 2mL ·min21 , waters Atlantis C18 柱 , (41 6 mm ×15 cm , 5 μm) 。梯度洗脱 。按 外标法测定醋酸含量[5 ] 。
氨基酸序列测定结果与理论值一致 。红外图谱 结果也与国外对照品一致 。
通过质谱 、氨基酸序列测定 、氨基酸组成分析 和红外测定 , 首批醋酸奥曲肽国家对照品的结构得 到确认 。 31 3 含量确定
3 个组分别对待标品按照扣除法进行了含量测 定 , 计算公式为含量 = (11 02水分 % - 醋酸 %) × (11 0 - 有关物质 %) 。测定结果见表 1 。
奥曲肽的分子式为 C49 H66 N10 O10 S2 , 理论相对 分子量为 10191 24 , 经 TO F2MALDI2MS 分析测得 其准分子离子峰 (M + H) + 为 10201 25 , 因此其相
对分子质量为 10191 25 , 与理论值一致 。见图 1 。
图 1 奥曲肽的准分子离子峰图
按《中国药典》2005 年版细菌内毒素检查法 , 取 3 批供试品分别用 2 批不同厂家的鲎试剂对其进 行细菌内毒素检查 , 结果见表 6 。
表 6 供试品细菌内毒素检测结果
TAL 批号
供试品
供试品 阳性
供试品
批号
阳性对照 对照
阴性 对照
20050209
20050103 - 20050104 - 20050105 - -
21 5 水分测定 采用卡氏水分测定仪对样品进行水分测定[6] 。
21 6 有关物质测定 反相色谱法 , 条件同纯度测定 。精密称取供试
品适量 , 用水溶解并定容 , 取 11 0mL 置 100mL 量 瓶中定容作为自身对照 。
21 7 氮含量测定 按照《中国药典》2005 年版二部附录测定 。
( Peninsula Laborato ries ) , 氨基酸对照品 (中国 药品生物制品检定所) ; 二巯基苏糖醇 ( Sigma) , MALDI 校正标准肽 PR14 ( Sigma) , 基质α2氰基2 42羟基肉桂酸 ( C HCA , Sigma) , 三氟乙酸 ; 碳酸 氢铵 , 脲 。 2 方法 21 1 相对分子质量和氨基酸序列测定
相对分子质量测试范围为 0～2000 m/ z , 正离 子反射模式 , MALDI 校正标准肽 PR14 和 C HCA 做内标校正 。
取基 质 α2氰 基242羟 基 肉 桂 酸 10mg , 加 入 1 mL 01 1 % TFA 溶液 , 静置 30 分钟 , 离心取上清 液作 基 质 溶 液 。取 校 正 标 样 1 支 , 加 入 1 mL 01 1 %的 TFA 溶解作内标 。取醋酸奥曲肽适量 , 加入 1 mL 01 1 %的 TFA 溶解 , 经脱盐处理后 , 即 得奥曲肽供试品溶液 。称取 01 5 mg 奥曲肽原料 , 加入 p H = 81 0 的脲溶液溶解 , 混匀 , 配成 10μg ·
表 1 待标醋酸奥曲肽含量测定结果 %
项目 第一组 (n = 5) 均值 RSD
水分 41 29 11 2 醋酸 81 38 01 9 有关物质 01 80 11 4 含量 861 63
第二组 (n = 5) 均值 RSD 41 3 11 4 81 4 11 0 01 71 11 5 861 68
内毒素的检测 , 首先要证实该样品本身是否存在干 扰因素 , 进行干扰试验的目的就是要确定该品种在 何种有效浓度范围内进行细菌内毒素检查时既可克 服干扰因素 , 又能客观反映其所含的细菌内毒素量 是否符合规定限值 。
醋酸奥曲肽为人工合成的生长抑素类似物 , 其作用与天然生长抑素 ( So mato statin) 相似 。因 是环肽 , 故半衰期比天然生长抑素长 。本品具有抑 制生长激素 、胰高血糖素和胰岛素的作用 , 临床上 应用日益广泛 。
目前醋酸奥曲肽已有多家新药上市 , 而各国药 典均未收载 , 且无国际对照品 。为满足醋酸奥曲肽 的国内外产品的生产检定 , 有效的控制其质量 , 我 们研制了首批醋酸奥曲肽对照品 。 1 仪器与试剂 11 1 仪器
中国药事 2007 年第 21 卷第 10 期
819
首批国家醋酸奥曲肽对照品的研制
赵宗阁 , 郝苏丽 , 杨化新 , 卓开华1 , 高家敏2 (中国药品生物制品检定所 , 北京 100050 ;
1 宁波市药品检验所 ; 2 重庆市药品检验所)
摘要 : 建立首批醋酸奥曲肽的国家对照品 。应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 ( MALDI2TO F2 MS) 、氨基酸序列测定仪 、氨基酸组成分析 、红外光谱仪和旋光仪等对醋酸奥曲肽进行结构确证 , 并采用 高效液相法测定纯度 、检测醋酸含量和氨基酸组成 。对 3 个厂家的原料进行筛选 , 最终确定首批醋酸奥 曲肽对照品的含量为 861 7 %。首批国家醋酸奥曲肽对照品的建立可有效的控制产品质量 。
理论上奥曲肽八个氨基酸残基中有两个半胱氨 酸残基分别位于第二位和第七位 , 两者之间形成二 硫键 。通过分析还原后奥曲肽质谱图可以看出 , 其 相对分子质量增加 2 ,证明第二和第七位半胱氨酸 残基之间有二硫键相连 ,与理论预期一致 。见图 2 。
图 2 还原奥曲肽的准分子离子峰图
由于苏氨醇为变构氨基酸 , 在常规的氨基酸分 析中不能测出 。其余氨基酸的组成比分别为 Val 11 0 , Phe 21 2 , L ys 11 0 , Trp 01 9 , 与理论值基本 一致 。
关键词 : 醋酸奥曲肽 ; 二硫键 ; 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪
中图分类号 : R9271 11 文献标识码 : A 文章编号 : 100227777 (2007) 1020819203
Preparation and Standardization of the Reference Standard of Octreotide Acetate Zhao Zo ngge , Hao suli , Yang huaxin , Zhuo kaihua1 and Gao jiamin2 ( Natio nal Instit ute fo r t he Co nt rol of Pharmaceutical and Biolo gical Pro duct s , Beijing 100050 ; 1 Ning Bo Instit ute fo r Drug Co nt rol ; 2 Cho ng Qing Instit ute fo r Drug Co nt rol) ABSTRACT To establish t he reference standard of oct reotide acetate1 The st ruct ure was co nfirmed by MALD I2TO F2MS , peptide sequencer , anmino acid analysis , IR spect ro meter and polariscope , t he co ntent of acetic acid and t he p urit y of oct reotide acetate was determined by H PL C1 Three raw material s were screened , o ne of t hem was selected as t he reference material and t he co ntent of oct reotide was 861 7 %1 The reference standard established can efficiently co nt rol t he qualit y of oct reotide acetate p roduct s1 KEY WORDS oct reotide acetate ; disulfide bo nd ; MALDI2TO F2MS
批号
01 5 ( EU ·mL21)
水 20050103 20050104 20050105
++++ ++++ ++++ ++++
注 “: + ”表示阳性 “; 2”表示阴性 。
01 25 ( EU ·mL21)
++++ ++++ ++++ ++++
01 125 ( EU 来自百度文库mL21)
-------------
甲基氢氧化铵2水 (20 ∶4 ∶176) , 流动相 B 为乙腈2 1 mol ·L21 四甲基氢氧化铵2水 (60 ∶2 ∶38) , 01 45 μm 膜抽滤 。检测波长 210 nm , 进样体积 20 μL , 流速 11 0 mL ·min21 , 色 谱 柱 为 Lichro sp her RP C18 (41 6 mm ×25 cm ,5 μm) ; 柱温 30 ℃, 梯度洗 脱 。样品用流动相 A 溶解 , 01 45μm 滤膜过滤[324] 。 21 4 醋酸含量测定
++
++ - -
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20040532
20050103 - 20050104 - 20050105 - -
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++
++ - -
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注 “: + ”表示阳性 “; 2”表示阴性 。
3 讨论 TAL 用于细菌内毒素的检测具有操作简单 ,
灵敏度 、重现性好 , 实用性强等优点 。一种新药是 否可用细菌内毒素检查法替代热原检查法进行细菌
01 0625 ( EU ·mL21)
-------------
阴性
-----
Et 值
/ 01 25 01 25 01 25
Es 值
01 25 / / /
Es/ Et
/ 1 1 1
干扰试验结果表明 : 注射用头孢噻肟钠他唑巴 坦钠 10mg ·mL21 (以头孢噻肟钠计) 对鲎试剂的 凝集反应无增强或抑制作用 。 21 5 供试品细菌内毒素检查
第三组 (n = 5) 均值 RSD 41 28 11 3 81 35 11 1 01 76 11 3 861 71
均值 861 7
(下转第 844 页)
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中国药事 2007 年第 21 卷第 10 期
表 5 供试品干扰试验结果 (湛江博康海洋生物有限公司λ= 01 25 EU ·mL21 ) , 批号 : 20040532)
醋酸奥曲肽 (厂 A , 批号 040315 , 厂 B , 批号 041210 , 厂 C , 批号 E08046) , 醋酸奥曲肽对照品
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中国药事 2007 年第 21 卷第 10 期
μL21 的溶液 , 取 10μL , 加入 45 mmol ·L21 二巯基 苏糖醇溶液 5 μL , 50 ℃加热 15 min , 作为还原奥 曲肽供试品溶液 [1] 。
21 2 氨基酸组成分析 按照相关文献方法测定[223 ] 。
21 3 纯度分析 反相色谱法 , 流动相 A 为乙腈21 mol ·L21 四
21 8 氨基酸序列 委托北京大学生命科学院测定 。
21 9 红外光谱 委托本所仪器分析室测定 。
3 结果与讨论 31 1 原料分析与待标品制备
采用面积归一化计算 , A 、B 和 C 3 个厂家的 奥曲肽的纯度分别为 1001 0 % , 991 5 %和 991 6 %。 表明 3 个样品纯度均符合要求 。水分含量分别为 51 1 % , 21 3 % , 和 41 3 % , 比旋度分别为2441 2°、2 451 4°和2441 0°, 均符合要求 。考虑到水分含量 , 最 后选用厂家 C 的样品作为首批国家醋酸奥曲肽对 照品原料 , 并按要求进行分装制备待标品 。 31 2 结构确证
反相色谱法 , 流动相 A 为 p H = 31 0 的磷酸溶 液 。流动相 B 为甲醇 , 检测波长 210 nm , 进样体 积 20 μL , 流速 11 2mL ·min21 , waters Atlantis C18 柱 , (41 6 mm ×15 cm , 5 μm) 。梯度洗脱 。按 外标法测定醋酸含量[5 ] 。
氨基酸序列测定结果与理论值一致 。红外图谱 结果也与国外对照品一致 。
通过质谱 、氨基酸序列测定 、氨基酸组成分析 和红外测定 , 首批醋酸奥曲肽国家对照品的结构得 到确认 。 31 3 含量确定
3 个组分别对待标品按照扣除法进行了含量测 定 , 计算公式为含量 = (11 02水分 % - 醋酸 %) × (11 0 - 有关物质 %) 。测定结果见表 1 。
奥曲肽的分子式为 C49 H66 N10 O10 S2 , 理论相对 分子量为 10191 24 , 经 TO F2MALDI2MS 分析测得 其准分子离子峰 (M + H) + 为 10201 25 , 因此其相
对分子质量为 10191 25 , 与理论值一致 。见图 1 。
图 1 奥曲肽的准分子离子峰图
按《中国药典》2005 年版细菌内毒素检查法 , 取 3 批供试品分别用 2 批不同厂家的鲎试剂对其进 行细菌内毒素检查 , 结果见表 6 。
表 6 供试品细菌内毒素检测结果
TAL 批号
供试品
供试品 阳性
供试品
批号
阳性对照 对照
阴性 对照
20050209
20050103 - 20050104 - 20050105 - -
21 5 水分测定 采用卡氏水分测定仪对样品进行水分测定[6] 。
21 6 有关物质测定 反相色谱法 , 条件同纯度测定 。精密称取供试
品适量 , 用水溶解并定容 , 取 11 0mL 置 100mL 量 瓶中定容作为自身对照 。
21 7 氮含量测定 按照《中国药典》2005 年版二部附录测定 。
( Peninsula Laborato ries ) , 氨基酸对照品 (中国 药品生物制品检定所) ; 二巯基苏糖醇 ( Sigma) , MALDI 校正标准肽 PR14 ( Sigma) , 基质α2氰基2 42羟基肉桂酸 ( C HCA , Sigma) , 三氟乙酸 ; 碳酸 氢铵 , 脲 。 2 方法 21 1 相对分子质量和氨基酸序列测定
相对分子质量测试范围为 0～2000 m/ z , 正离 子反射模式 , MALDI 校正标准肽 PR14 和 C HCA 做内标校正 。
取基 质 α2氰 基242羟 基 肉 桂 酸 10mg , 加 入 1 mL 01 1 % TFA 溶液 , 静置 30 分钟 , 离心取上清 液作 基 质 溶 液 。取 校 正 标 样 1 支 , 加 入 1 mL 01 1 %的 TFA 溶解作内标 。取醋酸奥曲肽适量 , 加入 1 mL 01 1 %的 TFA 溶解 , 经脱盐处理后 , 即 得奥曲肽供试品溶液 。称取 01 5 mg 奥曲肽原料 , 加入 p H = 81 0 的脲溶液溶解 , 混匀 , 配成 10μg ·
表 1 待标醋酸奥曲肽含量测定结果 %
项目 第一组 (n = 5) 均值 RSD
水分 41 29 11 2 醋酸 81 38 01 9 有关物质 01 80 11 4 含量 861 63
第二组 (n = 5) 均值 RSD 41 3 11 4 81 4 11 0 01 71 11 5 861 68
内毒素的检测 , 首先要证实该样品本身是否存在干 扰因素 , 进行干扰试验的目的就是要确定该品种在 何种有效浓度范围内进行细菌内毒素检查时既可克 服干扰因素 , 又能客观反映其所含的细菌内毒素量 是否符合规定限值 。
醋酸奥曲肽为人工合成的生长抑素类似物 , 其作用与天然生长抑素 ( So mato statin) 相似 。因 是环肽 , 故半衰期比天然生长抑素长 。本品具有抑 制生长激素 、胰高血糖素和胰岛素的作用 , 临床上 应用日益广泛 。
目前醋酸奥曲肽已有多家新药上市 , 而各国药 典均未收载 , 且无国际对照品 。为满足醋酸奥曲肽 的国内外产品的生产检定 , 有效的控制其质量 , 我 们研制了首批醋酸奥曲肽对照品 。 1 仪器与试剂 11 1 仪器
中国药事 2007 年第 21 卷第 10 期
819
首批国家醋酸奥曲肽对照品的研制
赵宗阁 , 郝苏丽 , 杨化新 , 卓开华1 , 高家敏2 (中国药品生物制品检定所 , 北京 100050 ;
1 宁波市药品检验所 ; 2 重庆市药品检验所)
摘要 : 建立首批醋酸奥曲肽的国家对照品 。应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 ( MALDI2TO F2 MS) 、氨基酸序列测定仪 、氨基酸组成分析 、红外光谱仪和旋光仪等对醋酸奥曲肽进行结构确证 , 并采用 高效液相法测定纯度 、检测醋酸含量和氨基酸组成 。对 3 个厂家的原料进行筛选 , 最终确定首批醋酸奥 曲肽对照品的含量为 861 7 %。首批国家醋酸奥曲肽对照品的建立可有效的控制产品质量 。
理论上奥曲肽八个氨基酸残基中有两个半胱氨 酸残基分别位于第二位和第七位 , 两者之间形成二 硫键 。通过分析还原后奥曲肽质谱图可以看出 , 其 相对分子质量增加 2 ,证明第二和第七位半胱氨酸 残基之间有二硫键相连 ,与理论预期一致 。见图 2 。
图 2 还原奥曲肽的准分子离子峰图
由于苏氨醇为变构氨基酸 , 在常规的氨基酸分 析中不能测出 。其余氨基酸的组成比分别为 Val 11 0 , Phe 21 2 , L ys 11 0 , Trp 01 9 , 与理论值基本 一致 。
关键词 : 醋酸奥曲肽 ; 二硫键 ; 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪
中图分类号 : R9271 11 文献标识码 : A 文章编号 : 100227777 (2007) 1020819203
Preparation and Standardization of the Reference Standard of Octreotide Acetate Zhao Zo ngge , Hao suli , Yang huaxin , Zhuo kaihua1 and Gao jiamin2 ( Natio nal Instit ute fo r t he Co nt rol of Pharmaceutical and Biolo gical Pro duct s , Beijing 100050 ; 1 Ning Bo Instit ute fo r Drug Co nt rol ; 2 Cho ng Qing Instit ute fo r Drug Co nt rol) ABSTRACT To establish t he reference standard of oct reotide acetate1 The st ruct ure was co nfirmed by MALD I2TO F2MS , peptide sequencer , anmino acid analysis , IR spect ro meter and polariscope , t he co ntent of acetic acid and t he p urit y of oct reotide acetate was determined by H PL C1 Three raw material s were screened , o ne of t hem was selected as t he reference material and t he co ntent of oct reotide was 861 7 %1 The reference standard established can efficiently co nt rol t he qualit y of oct reotide acetate p roduct s1 KEY WORDS oct reotide acetate ; disulfide bo nd ; MALDI2TO F2MS
批号
01 5 ( EU ·mL21)
水 20050103 20050104 20050105
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注 “: + ”表示阳性 “; 2”表示阴性 。
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甲基氢氧化铵2水 (20 ∶4 ∶176) , 流动相 B 为乙腈2 1 mol ·L21 四甲基氢氧化铵2水 (60 ∶2 ∶38) , 01 45 μm 膜抽滤 。检测波长 210 nm , 进样体积 20 μL , 流速 11 0 mL ·min21 , 色 谱 柱 为 Lichro sp her RP C18 (41 6 mm ×25 cm ,5 μm) ; 柱温 30 ℃, 梯度洗 脱 。样品用流动相 A 溶解 , 01 45μm 滤膜过滤[324] 。 21 4 醋酸含量测定
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注 “: + ”表示阳性 “; 2”表示阴性 。
3 讨论 TAL 用于细菌内毒素的检测具有操作简单 ,
灵敏度 、重现性好 , 实用性强等优点 。一种新药是 否可用细菌内毒素检查法替代热原检查法进行细菌
01 0625 ( EU ·mL21)
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阴性
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Et 值
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Es 值
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Es/ Et
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干扰试验结果表明 : 注射用头孢噻肟钠他唑巴 坦钠 10mg ·mL21 (以头孢噻肟钠计) 对鲎试剂的 凝集反应无增强或抑制作用 。 21 5 供试品细菌内毒素检查
第三组 (n = 5) 均值 RSD 41 28 11 3 81 35 11 1 01 76 11 3 861 71
均值 861 7
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表 5 供试品干扰试验结果 (湛江博康海洋生物有限公司λ= 01 25 EU ·mL21 ) , 批号 : 20040532)