蝴蝶兰组织培养

㈡试管苗茎尖的培养
材料: 材料 试管苗茎尖0.3mm左右 左右 试管苗茎尖
培养基:MS+BA 3～6mg/l+椰乳 培养基 ～ 椰乳 温度: 温度 光强: 光强: 25～28℃ ～ ℃ 光照时间8～ 光照时间8～10h/d
14d后茎尖膨大，呈浅绿色半球状，3个月后，可诱 后茎尖膨大，呈目九
蝴蝶兰的组织培养与快繁技术
教学内容
教学目标 工作任务 实践操作 问题探究 知识拓展 项目实践 作 业
教学目标
教学终极目标
会蝴蝶兰的组织培养和快速繁殖的技术方法和流程。 会蝴蝶兰的组织培养和快速繁殖的技术方法和流程。
促 成 目 标
能熟练进行蝴蝶兰花梗侧芽的消毒和培养 能进行原球茎诱导、继代、 能进行原球茎诱导、继代、生根与炼苗
三、胚状体发生的方式：
体细胞胚胎发生的方式有直接、间接两种： 体细胞胚胎发生的方式有直接、间接两种： ①从培养中的器官、组织、细胞或原生质体直接分化 从培养中的器官、组织、 成胚，中间不经过愈伤组织阶段。 成胚，中间不经过愈伤组织阶段。 ②外植体首先发生脱分化，然后由愈伤组织细胞分化 外植体首先发生脱分化， 为胚。后者较为常见。 为胚。后者较为常见。 间接发生方式一般要 胚胎发生丛与胚状体发育两个过程。 两个过程 有胚胎发生丛与胚状体发育两个过程。胚胎发 生丛是指细胞质浓、体积小常常聚集丛生、 生丛是指细胞质浓、体积小常常聚集丛生、且 是指细胞质浓 高度分化的一些愈伤组织细胞。 高度分化的一些愈伤组织细胞。
Comparison of moncot and dicot and gymnosperm somatic embryos A. Somatic embryo of orchardgrass growing from an embryogenic callus: coleoptile and notch B. Somatic embryo of grape growing from an embryogenic callus: two flattened cotyledons and subtending hypocotyl C. Somatic embryo of Norway spruce: multiple cotyledons and elongated hypocotyl.
MS+BA0.5㎎ +NAA0.1㎎/L+3%蔗糖 60天 蔗糖。 ①种子 ： MS+BA0.5㎎/L +NAA0.1㎎/L+3%蔗糖。60天。 +NAA0.5㎎/L培养基 培养基。 ②花梗：1/2MS+BA5.0㎎/L +NAA0.5㎎/L培养基。4周 花梗：1/2MS+BA5.0㎎
2、初代培养 、
项目介绍
蝴蝶兰：兰科，蝴蝶兰属； 蝴蝶兰：兰科，蝴蝶兰属；别 名：蝶兰，拉丁名： 蝶兰，拉丁名： Phalaenopsis amabilis 蝴蝶兰是单茎性附生兰，茎短， 蝴蝶兰是单茎性附生兰，茎短， 叶大，花茎一至数枚，花大， 叶大，花茎一至数枚，花大，因 花形似蝶得名。其花姿优美， 花形似蝶得名。其花姿优美，颜 色华丽，为热带兰中的珍品， 色华丽，为热带兰中的珍品，有 “兰中皇后”之美誉。 兰中皇后”之美誉。
胚状体 概念：体细胞胚或花粉胚是指在植物组织培 养中起源于1个非合子细胞，经过胚胎发生和 胚胎发育过程形成的胚状结构，通称胚体。
二、体细胞胚的发生过程：
⑴胚性愈伤组织诱导； 胚性愈伤组织诱导； 体胚诱导； ⑵体胚诱导； 体胚早期分化发育； ⑶体胚早期分化发育； 体胚成熟； ⑷体胚成熟； 体胚再生。 ⑸体胚再生。
合子经过短期的休眠后进行不均等分裂， 合子经过短期的休眠后进行不均等分裂，产生一个较大的 基细胞和一个较小的顶端细胞。 基细胞和一个较小的顶端细胞。 顶端细胞经若干次分裂后形成原胚，再依次经过球形期、 顶端细胞经若干次分裂后形成原胚，再依次经过球形期、 心形期、鱼雷形期和成熟期最终成为成熟胚. 心形期、鱼雷形期和成熟期最终成为成熟胚.
如何选择蝴蝶兰外植体？ 如何选择蝴蝶兰外植体？
蝴蝶兰进行组织培养快速繁殖常用的外植体主要 有茎尖、茎段、叶片、根尖、根段、花梗腋芽、 有茎尖、茎段、叶片、根尖、根段、花梗腋芽、花梗 节间切段、幼胚、种子等。 节间切段、幼胚、种子等。各个外植体培养成功的难 易程度不同，诱导率不同， 易程度不同，诱导率不同，适于的诱导培养的途径不 同。
蝴蝶兰属热带气生兰植物，原生种有 多种 多种， 蝴蝶兰属热带气生兰植物，原生种有70多种， 原产于我国台湾、菲律宾、印度尼西亚等地。 原产于我国台湾、菲律宾、印度尼西亚等地。蝴 蝶兰是单茎性气生兰，植株很少发育侧芽， 蝶兰是单茎性气生兰，植株很少发育侧芽，花似 蝴蝶，色泽丰富，形态美妙，花期长达 个月 个月， 蝴蝶，色泽丰富，形态美妙，花期长达3-4个月， 深受各国人民欢迎。 深受各国人民欢迎。
什么是胚状体的发生？ 什么是胚状体的发生？
一、概念： 概念： 1、胚胎发生: 胚的发育过程。 胚胎发生: 胚的发育过程。 2、体细胞胚胎或胚状体，简称体胚。 体细胞胚胎或胚状体，简称体胚。 在植物组织培养中起源于一个非合子细胞， 在植物组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎 发生、发育过程形成双极性的胚状结构。 发生、发育过程形成双极性的胚状结构。 含义： 含义： ①不同于合子胚，它不是两性细胞融合的产物； 不同于合子胚，它不是两性细胞融合的产物； 不同于孤雌胚或孤雄胚，它不是无融合生殖的产物； ②不同于孤雌胚或孤雄胚，它不是无融合生殖的产物； 不同于组培中器官发生途径形成的茎芽和根； ③不同于组培中器官发生途径形成的茎芽和根； 它是一个与合子胚的发育过程相似、具有双极性的胚状结构。 ④它是一个与合子胚的发育过程相似、具有双极性的胚状结构。
蝴蝶兰种子的无菌培养
实践操作
材料选择和消毒 生根培养
花梗消毒和接种
花梗侧芽培养
壮苗培养
初代培养 诱导原球茎
继代增殖
㈠花梗侧芽的消毒与培养
自来水冲洗，洗衣粉液浸泡 ～ 自来水冲洗，洗衣粉液浸泡5～7min，自来水反复洗 ，
外植体的选择→预处理→灭菌→接种
↓
75%酒精 浸泡 酒精 浸泡30s左右，0.1%升汞消毒 ～20min，无菌水冲 左右， 升汞消毒10～ 左右 升汞消毒 ， 洗3次 次
什么是原球茎？ 什么是原球茎？
原球茎最初是兰花种子发芽过程中的一种形态学 构造。种子萌发初期不出现胚根， 构造。种子萌发初期不出现胚根，而是原胚的萌动 和膨大，种皮的一端破裂，膨大的胚呈小圆锥状， 和膨大，种皮的一端破裂，膨大的胚呈小圆锥状， 称作原球茎。以后原球茎顶端产生突起， 称作原球茎。以后原球茎顶端产生突起，出现鳞片 状叶原基，形成子叶。也可理解为缩短的、呈珠粒 叶原基，形成子叶。也可理解为缩短的、 状的、由胚性细胞组成的、类似嫩茎的器官。 状的、由胚性细胞组成的、类似嫩茎的器官。
①种子： MS+BA5.0㎎/L 培养基上。60天，4cm高实生苗 种子： ㎎ 培养基上。 天 高实生苗 ②花梗：MS+BA5.0㎎/L 培养基上。4w苞叶处丛生小芽 花梗： ㎎ 培养基上。 苞叶处丛生小芽
3、继代培养与育苗 、 将原球茎切成数块转移到新鲜的初代培养基 椰乳、 上，附加15%椰乳、 0.5㎎/L +LAA6.0㎎/L 附加 椰乳 ㎎ ㎎ 腺嘌呤。 腺嘌呤。 4、试管苗的移栽与管理技术 、 试管苗的出瓶移栽技术与大花蕙兰相同。 试管苗的出瓶移栽技术与大花蕙兰相同。
蝴蝶兰属的拉丁学名是由Phala（蛾蝶）和Opsis（模样）组 （蛾蝶） 蝴蝶兰属的拉丁学名是由 （模样） 意指花外形似蛾蝶 该属植物约有4个原生种 花外形似蛾蝶。 个原生种， 成，意指花外形似蛾蝶。该属植物约有 个原生种，主要分布 在南北纬度23度之间 从喜马拉雅山经印度、缅甸、 度之间， 在南北纬度 度之间，从喜马拉雅山经印度、缅甸、中国南 马来西亚、菲律宾、澳大利亚和新几内亚。 部、马来西亚、菲律宾、澳大利亚和新几内亚。我国云南南 部、西藏南部、广东南部、海南和台湾一线为该属植物的最 西藏南部、广东南部、 北分布界限。 北分布界限。
培养基:MS+BA 3-5mg/l+胰蛋白胨 胰蛋白胨2g+椰乳 椰乳30g+糖 培养基 胰蛋白胨 椰乳 糖 35g+琼脂 琼脂12g/L，pH=5.0-5.4 琼脂 ， 温度:25～ ℃ 光照10～ 温度 ～28℃；光照 ～12h；光强 ；光强1500～2000lx。 ～ 。
培养
1、选材与消毒:75%酒精30S，0.1%升汞5min 选材与消毒:75%酒精30S，0.1%升汞5min :75%酒精30S 升汞
蝴蝶兰
工作任务
任务1 任务 任务2 任务 任务3 任务
由蝴蝶兰花梗诱导腋芽 对初代培养物诱导形成原球茎 对试管苗进行试管内生根培养 对生根苗进行驯化和移栽
任务4 任务
蝴蝶兰的繁殖
蝴蝶兰是单茎性气生兰，植株上极少发育侧枝， 蝴蝶兰是单茎性气生兰，植株上极少发育侧枝， 单茎性气生兰 比其他种类的兰花更难于进行常规无性繁殖。组织培 比其他种类的兰花更难于进行常规无性繁殖。 难于进行常规无性繁殖 养是建立蝴蝶兰快速繁殖无性系的重要手段。 养是建立蝴蝶兰快速繁殖无性系的重要手段。
㈣生根与炼苗
生根： 生根：MS+IAA0.5 70多 多 天后， 天后，具4～5条根 的小 ～ 条根 苗，可出瓶种植。 可出瓶种植。 炼苗：置于室温7～ 炼苗：置于室温7～10 d后，打开瓶盖 天，取 后 打开瓶盖2天 出小苗假植于水苔上。 出小苗假植于水苔上。
商业化生产
问题探究
1．如何选择蝴蝶兰外植体？ ．如何选择蝴蝶兰外植体？ 2．什么是原球茎？ ．什么是原球茎？ 3．什么是胚状体的发生？ ．什么是胚状体的发生？ 4．什么是人工种子？ ．什么是人工种子？
蝴蝶兰花梗组织培养
蝴蝶兰腋芽萌发
MS+BA3.0mg/L+NAA0.5mg/L+苹果汁 80g/L+蔗糖30g/L+琼脂10g/L+活性炭1g/L 为好。 培养条件：25℃，600lx，pH5.4~5.6
叶基部、叶中段、叶尖部 以基部0.5~1.0cm，上表面朝上平放为好 叶基部、叶中段、
㈢原球茎培养
原球茎诱导 试管苗的嫩叶： 试管苗的嫩叶：MS+BA 4～6mg/l+IBA 0.5～ ～ ～ 1mg/l+胰蛋白胨 胰蛋白胨2g/l+椰乳 椰乳40g/l 胰蛋白胨 椰乳 25～28℃，1500～2000lx，光照 ～ ℃ ～ ，光照10h/d，逐渐出 ， 现愈伤组织状的早期原球茎。 现愈伤组织状的早期原球茎。 原球茎继代培养 将原球茎切割长数小块， 继代培养50～ 将原球茎切割长数小块， 继代培养 ～60d转接 转接 一次，增殖倍数为10～ ， 一次，增殖倍数为 ～12，实现蝴蝶兰生产的工 厂化育苗。 厂化育苗。
为了大量繁殖， 为了大量繁殖，实现大规模的商业化 生产，采用蝴蝶兰的组织培养。 生产，采用蝴蝶兰的组织培养。取用蝴蝶 兰新鲜、侧芽饱满的花梗进行无菌培养， 兰新鲜、侧芽饱满的花梗进行无菌培养， 产生单株小苗。再进行试管苗茎尖培养， 产生单株小苗。再进行试管苗茎尖培养， 诱导为原球茎体。经原球茎培养， 诱导为原球茎体。经原球茎培养，继代扩 原球茎体 大增殖，可培养成蝴蝶兰小植株。 大增殖，可培养成蝴蝶兰小植株。
茎尖是较容易诱导培养、成功率较高的部位 但蝴 茎尖是较容易诱导培养、成功率较高的部位,但蝴 蝶兰为单茎性植物, 摘取其茎尖就有可能损失母株, 蝶兰为单茎性植物 摘取其茎尖就有可能损失母株 造 成浪费。 成浪费。 叶片作为外植体既可减少对母株的伤害,且取材不 叶片作为外植体既可减少对母株的伤害 且取材不 受季节限制。 受季节限制。 利用花梗及花梗芽作为外植体进行培养就是代替 蝴蝶兰茎尖培养的一种方法， 蝴蝶兰茎尖培养的一种方法，是目前进行蝴蝶兰组培 快繁最常选用的外植体。 快繁最常选用的外植体。
小麦幼胚愈伤组织诱导
四、影响器官和胚状体形成的因素
1、培养基成分 外源激素的种类、激动素与生长素的比例、 ①外源激素的种类、激动素与生长素的比例、激素的种类 与浓度调控着细胞培养方式及器官发生的类型。 与浓度调控着细胞培养方式及器官发生的类型。 无机物与有机物： 促进芽的分化。 ②无机物与有机物：PO4-3促进芽的分化。水解酪蛋白加强 激素诱导芽分化作用,水解酶蛋白能促进根的生长。 激素诱导芽分化作用,水解酶蛋白能促进根的生长。 氮素含量与生长素的比例、 氮素含量与生长素的比例、以及氮的形式与体胚的形 成有关。 成有关。 维生素：硫胺素与肌醇。 ③维生素：硫胺素与肌醇。 培养基的物理性质，如液体/固体、pH值 ④培养基的物理性质，如液体/固体、pH值、渗透压的大 糖的浓度等等。 小、糖的浓度等等。