水稻黄绿叶基因的克隆及应用

文章编号　：１００４－０３７４（２００７）０６－０６１４－０２

进一步提高水稻产量，最大限度满足国家对食物安全的需求是水稻遗传育种的重大任务。水稻干物质产量的９０％－9５％来自光合作用。目前高产水稻光能利用率也仅１．５％－2．０％。理论上，植物光能利用率可达１３．０％－1４．０％，水稻理想的光能利用率应达３．０％－5．０％［１］。因此，培育高光效的超高产品种是提高产量的主要途径之一。长期以来，水稻光合作用的相关研究大多停留在生理水平上，同时，传统的杂交育种手段在改良水稻光能利用方面至今尚未取得令人满意的结果，而叶色突变体是开展光合作用研究的理想材料。水稻黄绿叶突变体ｙｇｌ１是水稻栽培品种镇恢２４９的自然突变体，该突变体前期叶片为黄色，中期慢慢转绿，后期叶色接近野生型。与野生型相比，ｙｇｌ１突变体有较高光合效率和较强的耐受光抑制能力，因而仍能获得较高的产量（亩产９００．１２斤）。

高等植物叶绿素的生物合成与叶绿体的发育对其能否进行正常的光合作用起关键作用［２］。叶绿体的许多蛋白复合体的蛋白和叶绿素生物合成所需酶类都是由核基因及质体基因编码。同时，叶绿素的合成与叶绿体的发育涉及核基因和叶绿体基因协同调控的复杂过程，其中一些基因的突变将造成叶绿素缺乏或叶绿体发育缺陷，导致光合作用受阻［３－５］。从黄绿叶突变体ｙｇｌ１克隆与叶绿素合成与降解、叶绿体分化与发育、光合作用代谢途径相关的新基因，对开展光合系统结构、光合机构的应答及其调控机制研究有重要意义，也为水稻高光效生理研究和水稻黄绿叶突变体ｙｇｌ１在生产上的应用提供了理论依据。

在国家“８６３”、“９７３”计划以及国家自然科学基金等项目的支持下，南京农业大学水稻研究所、中国农业科学院作物科学研究所等单位的科研人员利用黄绿叶突变体ｙｇｌ１为材料，通过数年研究，克隆出水稻黄绿叶突变基因ｙｇｌ１，且从生理生化、细胞形态学等方面对ｙｇｌ１突变体进行了比较系统的研究［６］。研究表明，ＹＧＬ１基因编码叶绿素合成酶，催化叶绿素合成过程中最后一步叶绿素ａ的形成。核苷酸序列分析发现突变体与野生型在叶绿素合成酶基因的编码区上有单个碱基差异，由胸腺嘧啶（Ｔ）突变为胞嘧啶（Ｃ），造成所编码的脯氨酸（Ｐｒｏｌｉｎｅ）到丝氨酸（Ｓｅｒｌｉｎｅ）的改变，其具体研究过程如下：

为了研究ｙｇｌ１突变体的遗传特性，用ｙｇｌ１突变体分别与ＰＡ６４、Ｗ００２、ＵＳＳＲ５和０２４２８等几个栽培品种构建了四个正反交杂交组合，结果所有的Ｆ１显示野生型绿苗表型，后代Ｆ２出现黄、绿苗分离，分离比接近３∶１，经χ2测验（χ2＜χ2０．０５＝３．８４；Ｐ＞０．０５），符合３∶１分离，表明ｙｇｌ１的黄绿叶表型由一对隐性核基因控制。

利用已公布图谱上ＳＳＲ分子标记和ｙｇｌ１突变体与培矮６４杂交组合衍生的Ｆ２代临时性分离群体的２５２个突变体单株对突变基因进行初步定位［７］，把突变基因定位于第５染色体上ＳＳＲ标记ＲＭ５１６和ＲＭ１６４之间，遗传距离分别为４．８　ｃＭ和１３．１　ｃＭ；随后通过扩大定位群体，并根据水稻基因组数据开发新型分子标记［８］，构建了ｙｇｌ１基因区域高密度遗传图谱和细菌人工染色体重叠群，最终将突变基因精细定位于细菌人工染色体ＡＣ１３６２２１上大约１１ｋｂ区间内，与基于ＰＣＲ的剪切扩增多态性（ｃｌｅａｖｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄ pｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ＣＡＰＳ）标记Ｐ２５、Ｐ２６共分离。利用基因分析与预测软件对定位的１１　ｋｂ区域进行预测，发现仅有两个开放阅读框（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅｓ，　ＯＲＦｓ）　：一个为叶绿素合成酶基因（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｇｅｎｅ）［９－１３］　，我们把它称为

水稻黄绿叶基因的克隆及应用

吴自明１，张　欣２，万建民２＊

（１南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，江苏省植物基因工程中心，南京　２１００９５；

２　中国农业科学院作物科学研究所，北京　１０００８１）

·研究快讯·

615第６期吴自明，等：水稻黄绿叶基因的克隆及应用

ＹＧＬ１基因；另一个为ｅｍ基因（ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃａｂｓｃｉｓｉａｃｉｄ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｇｅｎｅ）。通过ＲＴ－ＰＣＲ分别扩增野生型和突变体两个开放阅读框编码区ｃＤＮＡ，测序后分析发现野生型和突变体的ｅｍ基因ｃＤＮＡ没有任何差异，仅在叶绿素合成酶基因ＹＧＬ１的编码区ｃＤＮＡ上有单碱基差异，由胸腺嘧啶突变为胞嘧啶，造成脯氨酸到丝氨酸的改变。因此，我们把ＹＧＬ１基因确定为ｙｇｌ１的候选基因。

进一步构建了含有ＹＧＬ１编码区ｃＤＮＡ双元表达载体，通过农杆菌介导的方法将此基因转化到具有ｙｇｌ１等位基因黄绿叶表型的粳稻品系黄叶粳，恢复绿色表型的植株经ＰＣＲ检测、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ分析、Ｔ１代分离实验及恢复表型植株叶绿素含量分析，证明ＹＧＬ１就是ｙｇｌ１突变体的突变基因。ＹＧＬ１以单拷贝的形式存在于水稻基因组中，编码叶绿素合成酶，催化叶绿素酸酯植醇化，生成叶绿素ａ，这一合成步骤对叶绿素ａ辅基蛋白的翻译和积累，类囊体膜组分的稳定装配起重要作用［１４］。氨基酸序列同源性和进化树分析表明，不同物种叶绿素合成酶基因有很强的保守性，水稻叶绿素合成酶ＹＧＬ１与同为禾本科植物燕麦的叶绿素合成酶比其他生物有更近的亲缘关系。体外原核表达重组蛋白酯化活性分析显示，突变基因重组蛋白ｙｇｌ１较野生型ＹＧＬ１重组蛋白酯化活性下降，表明脯氨酸到丝氨酸的改变，导致叶绿素合成酶活性下降；ｙｇｌ１突变体的叶绿素积累速率减慢和叶绿素合成中间产物的积累也充分表明叶绿素合成酶催化活性下降；ＹＧＬ１具有组成型表达特性，单碱基突变并没有影响到突变体体内的表达水平，然而，与叶绿素合成和叶绿体发育相关的基因表达受到了不同程度的影响，尤其是编码叶绿素ａ／ｂ结合蛋白ｃａｂ１Ｒ基因在苗期叶片中的表达受到强烈抑制，这些结果为叶绿素或叶绿素中间代谢产物水平反馈调控编码叶绿体相关核基因表达提供了直接的证据。

叶绿素在光合作用的光能吸收、传递和转换中起着关键作用。早期研究认为，在一定范围内，叶绿素含量与光合速率成正相关关系。水稻在经济器官形成和充实期，剑叶叶绿素含量保持在较高水平，能使叶片保持较高的光合速率。水稻黄绿叶突变体ｙｇｌ１，其叶绿素ｂ含量适量减少，　降低捕光色素的比例，但是提高光合作用的活性，　同时降低在高光强下的光抑制现象。该突变体抽穗前叶绿素含量与野生型没有显著差异，这是突变体仍能获得较高产量的主要原因。

水稻黄绿叶突变体ｙｇｌ１叶绿素含量适当减少，光合结构对强光的耐受性升高，最大光合速率显著上升，所以水稻黄绿叶突变体ｙｇｌ１不仅可用于叶绿素生物合成、叶绿体分化与发育和水稻高光效生理的研究等基础研究，其黄绿叶特性还可作为标记性状在杂种优势利用中应用，如在良种繁育和杂交育种实践中，可以通过回交转育或转基因的方法，将ｙｇｌ１黄绿叶基因导入光（温）敏两用核不育系当中，利用叶色变异作为标记性状，不但可以测定水稻种子纯度，大大降低田间检测种子纯度的成本和时间，还可在苗期去杂，克服光（温）敏核不育系在制种时常见的由于温度变化而造成育性恢复，导致杂种Ｆ１纯度不同程度的下降所带来的杂交稻产量下降的损失，对简化杂交稻纯度鉴定手续、节约纯度鉴定时间和费用及提供杂交稻生产的田间纯度具有重要意义。

［参　考　文　献］

［１］Ｌｏｏｍｉｓ　Ｒ　Ｓ，　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　Ｗ　Ａ．　Ｍａｘｉｍｕｍ　ｃｒｏｐ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ：　ａｎｅｓｔｉｍａｔｅ．　Ｃｒｏｐ　Ｓｃｉ，　１９６３，　３：　６７－７２

［２］Ｅｃｋｈａｒｄｔ　Ｕ，　Ｇｒｉｍｍ　Ｂ，　Ｈｏｒｔｅｎｓｔｅｉｎｅｒ　Ｓ．　Ｒｅｃｅｎｔ　ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｂｒｅａｋｄｏｗｎ　ｉｎ　ｈｉｇｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ．

Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，　２００４，　５６：　１-1４

［３］Ｆａｌｂｅｌ　Ｔ　Ｇ，　Ｓｔａｅｈｅｌｉｎ　Ｌ　Ａ．　Ｐａｒｔｉａｌ　ｂｌｏｃｋ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅａｒｌｙ　ｓｔｅｐｓ　ｏｆｔｈｅ　ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｐａｔｈｗａｙ：　Ａ　ｃｏｍｍｏｎ　ｆｅａｔｕｒｅ　ｏｆ

ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ　ｂ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｍｕｔａｎｔｓ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，　１９９６，　９７：

３１１－３２０

［４］Ｊｕｎｇ　Ｋ　Ｈ，　Ｈｕｒ　Ｊ，　Ｒｙｕ　Ｃ　Ｈ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｒｉｃｅｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｍｕｔａｎｔ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｔ－ＤＮＡ　ｇｅｎｅ－ｔｒａｐ

ｓｙｓｔｅｍ．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，　２００３，　４４：　４６３－４７２

［５］Ｔａｎｙａ　Ｃ　Ｆ，　Ｓｔａｅｈｅｌｉｎ　Ｌ　Ａ．　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｗｈｅａｔ　（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）　ａｎｄ　ｂａｒｌｅｙ　（Ｈｏｒｄｅｕｍ

ｖｕｌｇａｒｅ）　ｍｕｔａｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｄｅｆｅｃｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍａｇｎｅｓｉｕｍ－ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ

ｓｔｅｐ　ｏｆ　ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，　１９９４，　１０４：

６３９－６４８

［６］Ｗｕ　Ｚ　Ｍ，　Ｚｈａｎｇ　Ｘ，　Ｈｅ　Ｂ，　ｅｔ　ａｌ．　Ａ　ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｒｉｃｅｍｕｔａｎｔ　ｗｉｔｈ　ｉｍｐａｉｒｅｄ　ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｉｄｅ　ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ

ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，　２００７，　１４５：　２９－

４０

［７］ＭｃＣｏｕｃｈ　Ｓ　Ｒ，　Ｔｅｙｔｅｌｍａｎ　Ｌ，　Ｘｕ　Ｙ　Ｂ．　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄｍａｐｐｉｎｇ　ｏｆ　２２４０　ｎｅｗ　ＳＳＲ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｆｏｒ　ｒｉｃｅ　（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ

Ｌ．）．　ＤＮＡ　Ｒｅｓ，　２００２，　９：　１９９－２０７

［８］Ｔｈｉｅｌ　Ｔ，　Ｋｏｔａ　Ｒ，　Ｇｒｏｓｓｅ　Ｉ，　ｅｔ　ａｌ．　ＳＮＰ２ＣＡＰＳ：　ａ　ＳＮＰ　ａｎｄＩＮＤＥＬ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｔｏｏｌ　ｆｏｒ　ＣＡＰＳ　ｍａｒｋｅｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ

Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，　２００４，　３２：　ｅ５

［９］Ｌｉｎｄｓｔｅｎ　Ａ，　Ｗｅｌｃｈ　Ｃ　Ｊ，　Ｓｃｈｏｃｈ　Ｓ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ　ｓｙｎ－ｔｈｅｔａｓｅ　ｉｓ　ｌａｔｅｎｔ　ｉｎ　ｗｅｌｌ－ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ　ｐｒｏｌａｍｅｌｌａｒ　ｂｏｄｉｅｓ　ｏｆ　ｅｔｉ－

ｏｌａｔｅｄ　ｗｈｅａｔ．　Ｐｈｙｓｉｏｌｇｉａ　Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，　１９９０，　８０：　２７７

［１０］Ｌｏｐｅｚ　Ｊ　Ｃ，　Ｒｙａｎ　Ｓ，　Ｂｌａｎｋｅｎｓｈｉｐ　Ｒ　Ｅ．　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｃｈＧｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ：　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ

ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｐｏｌｙｐｒｅｎｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ．　Ｊ

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，　１９９６，　１７８：　３３６３-3３７３

［１１］Ｏｓｔｅｒ　Ｕ，　Ｂａｕｅｒ　Ｃ　Ｅ，　Ｒüdｉｇｅｒ　Ｗ．　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈｌｏｒｏ－ｐｈｙｌｌ　ａ　ａｎｄ　ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ　ａ　ｓｙｎｔｈａｓｅｓ　ｂｙ　ｈｅｔｅｒｏｌｏ－

ｇｏｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ．　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，　１９９７，　２７２：

９６７１－９６７６

［１２］Ｏｓｔｅｒ　Ｕ，　Ｒüdｉｇｅｒ　Ｗ．　Ｔｈｅ　Ｇ４　ｇｅｎｅ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａｅｎｃｏｄｅｓ　ａ　ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｏｆ　ｅｔｉｏｌａｔｅｄ　ｐｌａｎｔｓ．　Ｂｏｔ　Ａｃｔａ，

１９９７，　１１０：　４２０－４２３

［１３］Ｓｃｈｍｉｄ　Ｈ　Ｃ，　Ｏｓｔｅｒ　Ｕ，　Ｋögｅｌ　Ｊ．　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎｏｆ　ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ａｖｅｎａ　ｓａｔｉｖａ．　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，

２００１，　３８２：　９０３　-９１１

［１４］Ｓｃｈｍｉｄ　ＨＣ，　Ｒａｓｓａｄｉｎａ　Ｖ，　Ｏｓｔｅｒ　Ｕ．　Ｐｒｅ－ｌｏａｄｉｎｇ　ｏｆ　ｃｈｌｏｒｏ－ｐｈｙｌｌ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｗｉｔｈ　ｔｅｔｒａｐｒｅｎｙｌ　ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｉｓ　ａｎ　ｏｂｌｉｇａ－

ｔｏｒｙ　ｓｔｅｐ　ｉｎ　ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，　２００２，

３８３：　１７６９　-

１７７６