水溶性壳聚糖对几种常见菌的抑制作用及其机理初探

供试菌种
大肠杆菌 金黄色葡萄球菌
白色念珠菌 变形杆菌 绿脓杆菌
％ 水溶性壳聚糖浓度／％
０ ０．５ ０．２５ ０．１２５ ０．０６２５ ０．０３１２５
０ ８０ ９０ １００ １００ ８５
０ ８５ １００ １００ ９０ ８５
０ ５０ ５０ ５０ ８５ ７０
０ ７０ ５０ ３２ １５
０
０ ５０ ７５ ７５ ８５ ７０
Ｉｎｉｔｉａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｈｙｄｒｏｓｏｌｕｂｌｅ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｏｎ ｃｏｍｍｏｎ ｂａｃｔｅｒｉａ
ＹＡＮＧ Ｓｈｅｎｇ１，ＦＥＮＧ Ｘｉａｏ－ｑｉａｎｇ２，ＬＩ Ｘｉａｏ－ｆａｎｇ２，ＦＵ Ｇｕｏ－ｑｉｎｇ３，Ｗａｎｇ Ｔｉｎｇ－ｐｕ２，ＳＵ Ｚｈｏｎｇ－ｘｉｎ２
如果抑菌剂能杀死或抑制皿中供试菌的生长，则 在滤纸片的周围会出现一个无菌生长的透明圈，即抑 菌圈。以抑菌圈的直径作为评定指标，抑菌圈直径越大， 说明对供试菌的抑制效果越好，反之则抑制效果越差。
２．２．５ 水溶性壳聚糖在各被试浓度下的抑菌率 各平皿内加入一定浓度的水溶性壳聚糖，然后每
皿倒入２０ ｍＬ熔化的琼脂培养基，混匀，冷却凝固后加 入１００μＬ ０．５Ｍｃｆ（麦氏单位）的菌悬液，涂布均匀，按 如上方法培养。以不含水溶性壳聚糖的培养基中生长的菌 落为对照，计算抑菌率。每个浓度重复２次，取其平均值。抑 菌率（η）的计算公式：
摘 要： 采用固体培养基体外抑菌法，研究了水溶性壳聚糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、白色念珠菌、绿脓杆菌的 抑菌作用。结果表明，水溶性壳聚糖在１ ％ＨＡｃ中的抑菌性强于在水中的抑菌性，在５种被试菌中，其对金黄色葡萄球菌和大肠杆 菌的抑制作用最强。并初步探讨了水溶性壳聚糖的抑菌机理。 关 键 词： 水溶性壳聚糖；抑菌作用；机理 中图分类号： ＴＳ ２０１．３ 文献标识码： Ａ 文章编号： ２０５４－ ０５７１（ ２００７） ０５－ ００１５－ ０４
大肠杆菌 （ＡＴＣＣ３５２１８）
６ ７ ＞８ ９ ９ ８
金黄色葡萄球菌 （ＡＴＣＣ２６１１３）
６ ７ ７ ７ １０ ＞８
变形杆菌 （ＡＴＣＣ１２４５３）
６ ７ ６ ６ ６ ６
白色念珠菌 （ＡＴＣＣ１０２３１）
６ ７ ７ ７ ８ ＞７
ｍｍ
绿脓杆菌 （ＡＴＣＣ２７８５３）
６ ７ ７ ７ ７ ６
研究报告
８
９
９
８
＞７
由表１、表２可以看出，水溶性壳聚糖在１％ＨＡｃ中的 抑菌性能比溶于水时有较大的改善，尤以大肠杆菌和金 黄色葡萄球菌最为明显。说明水溶性壳聚糖只有在酸性 介质中才能具有更好的抑菌效果，这可能与氨基的质 子化有关。 ３．２ 浓度对抑菌性能的影响
无 论 是 将 水 溶 性 壳 聚 糖 溶 于 水 还 是 溶 于 １％ ＨＡｃ 中，其对各被试菌的抑菌作用与浓度不成正比，总体趋 势为先增强后减弱。对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、 变 形杆菌、白色 念 珠 菌 、绿 脓 杆 菌 的 最 佳 抑 菌 浓 度 分 别为０．１２５％、０．１２５％、０．５％、０．０６２５％、０．０６２５％。这可能 与水溶性壳聚糖独特的抑菌机理有关。 ３．３ 不同浓度水溶性壳聚糖对各供试菌的抑菌率
η＝（Ｎ２－Ｎ１）／Ｎ１×１００％。
式中：Ｎ１、Ｎ２分别是指空白平板和涂有壳聚糖的平板上的菌落数。
３ 结果与讨论 ３．１ 溶剂对抑菌性能的影响
水溶性壳聚糖溶于水和１％ＨＡｃ时对各供试菌的抑 菌圈测量，结果见表１、表２。
壳聚糖浓度／％
０ ０．５ ０．２５ ０．１２５ ０．０６２５ ０．０３１２５
表１ 水溶性壳聚糖溶于水时对各供试菌的抑菌圈 Ｔａｂｌｅ １． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｓ ｏｌｕｂｌｅ ｃｈｉｔｏｓ ａｎ ｄｉｓ ｓ ｏｌｖｅｄ ｉｎ ｗａｔｅｒ ｆｏｒ ｔｅｓ ｔｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ
２００７ Ｎｏ．５
·１６· Ｓ ｅｒｉａｌ Ｎｏ．１７０
Ｃｈｉｎａ Ｂｒｅ ｗｉｎｇ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｐｏｒｔ
２．１ 水溶性壳聚糖的制备［６］ 称取ＣＴＳ ３２ｇ，加入２％ ＨＡｃ ４００ ｍＬ，搅拌溶解后，
再用分液漏斗缓慢加入５％ Ｈ２Ｏ２ ２００ ｍＬ，６０℃回流反应 一定时间取样冷却、抽滤，将滤液用氢氧化钠溶液调节 ｐＨ值为１０，静置２ｈ后过滤，得非水溶性产品。滤液在 ５０℃减压浓缩，浓缩液用２￣３倍量的无水乙醇析出沉淀， 静置过滤，无水乙醇洗涤数次至中性，冷冻干燥，得水 溶性产品。 ２．２ 水溶性壳聚糖的体外抑菌实验 ２．２．１ 壳聚糖溶液的配制
大 肠 杆 菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、金 黄 色 葡 萄 球 菌 （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、变形杆菌（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ、白色 念珠菌（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、绿脓杆菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）：均 由天水市中医医院提供。 ２ 实验方法
收稿日期： ２００６－１１－１７ 基金项目： 天水师范学院科学研究基金资助项目（Ｘ３－０１） 作者简介： 杨 声（１９６３－），男，教授，主要从事电分析化学及高分子研究工作。
研究报告
中国酿造
２００７ 年 第 ５ 期
总第 １７０ 期 · １５ ·
水溶性壳聚糖对几种常见菌的抑制作用及其机理初探
杨 声１， 冯小强２， 伏国庆３， 王廷璞２， 苏中兴２， 李小芳２
（ １．天水师范学院 生命科学与化学学院， 甘肃 天水 ７４１００１； ２．兰州大学 化学化工学院， 甘肃 兰州 ７３００００； ３．天水市中医医院， 甘肃 天水 ７４１００１）
壳聚糖浓度／％
大肠杆菌 （ＡＴＣＣ３５２１８）
金黄色葡萄球菌 （ＡＴＣＣ２６１１３）
变形杆菌 （ＡＴＣＣ１２４５３）
白色念珠菌 （ＡＴＣＣ１０２３１）
绿脓杆菌 （ＡＴＣＣ２７８５３）
０
６
６
６
０．５
８
９
８
０．２５
＞９
１２
７
０．１２５
１１
＞１２
６
０．０６２５
１０
１１
６
０．０３１２５
９
１０
６
６
６
７
７
７
８
７
表３ 不同浓度水溶性壳聚糖溶于１％ ＨＡｃ 时 对 各 供 试 菌 的 抑 菌 率
Ｔａｂｌｅ ３． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｓ ｏｌｕｂｌｅ ｃｈｉｔｏｓ ａｎ ｄｉｓ ｓ ｏｌｖｅｄ ｉｎ １％ ＨＡｃ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｅｓ ｔｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ
目前关于壳聚糖在抗菌、抑菌方面的研究很多，但 对于水溶性壳聚糖抗菌、抑菌作用规律的研究甚少，且 结论不一，对水溶性壳聚糖的抑菌机理的探讨还未见 报道。Ｈｏｎｇ Ｋｙｏｏｎ Ｎｏ［１］和ＪｅｏｎＹＪ［２］研究认为水溶性壳聚 糖对革兰氏阳性菌的抑制作用要强于革兰氏阴性菌， 但Ｃｈｅｎ Ｙ Ｍ［３］等认为水溶性壳聚糖革兰氏阴性菌的抑 制作用要强于革兰氏阳性菌。本文研究了自制水溶性 壳聚糖对５种常见菌的抑制作用，并在实验的基础上提 出了水溶性壳聚糖的抑菌机理，对水溶性壳聚糖的广 泛应用具有很好的指导意义。研究结果与文献［１－２］的 研究结论一致，但与文献 ［３］的结论恰好相反；另外，水 溶性壳聚糖的抑菌能力与浓度不成正比，适当低浓度 时抑菌效果最好，这与刘艳如、余萍等［４］的研究结果有 所不同。 １ 实验仪器和材料
（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｔｉａｎｓｈｕｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｉｔｙ，Ｔｉａｎｓｈｕｉ ７４１００１，Ｃｈｉｎａ； ２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｌａｎｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００００，Ｃｈｉｎａ； ３． Ｔｉａｎｓｈｕｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｔｉａｎｓｈｕｉ ７４１００１，Ｃｈｉｎａ）
中国酿造
２００７ 年 第 ５ 期
总第 １７０ 期 · １７ ·
表２ 水溶性壳聚糖溶于１％ＨＡｃ时对各供试菌的抑菌圈
Ｔａｂｌｅ ２． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｓ ｏｌｕｂｌｅ ｃｈｉｔｏｓ ａｎ ｄｉｓ ｓ ｏｌｖｅｄ ｉｎ １％ ＨＡｃ ｆｏｒ ｔｅｓ ｔｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｍｍ
１．１ 实验仪器 ＬＤＺＸ ４０Ｃ Ｉ 型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅：上
海中安医疗器械厂；ＤＨＧ ９０７０Ａ 型电热恒温干燥箱：Leabharlann Baidu上海益恒实验仪器有限公司；生化培养箱：国华电器； ＳＮＣＪ １ＢＵ无菌操作台：苏净集团安泰公司；ＤＥＮＳＩＭＡＴ 型细菌电比浊仪：法国生物梅里埃公司。 １．２ 实验材料 １．２．１ 水溶性壳聚糖自制（ＤＤ．８５．３％、粒度１００目、黏度 ３０ｍＰａ·ｓ），琼脂蛋白胨固体培养基（ｐＨ ７．１）［５］。 １．２．２ 供试菌种
分别以蒸馏水和１％ＨＡｃ为溶剂，稀释法配制浓度 为０．５％、０．２５％、０．１２５％、０．０６２５％、０．０３１２５％的壳聚糖溶液。 ２．２．２ 菌种的活化
受试菌种接种于固体培养基内，在３７℃ 活化２４ｈ。 ２．２．３ 菌悬液的制备
将活化后的受试菌种用接种环挑取菌苔于生理盐 水中，制成含菌数浊度约为０．５ Ｍｃｆ（麦氏单位）左右的 菌悬液备用。 ２．２．４ 抑菌测试方法（ 琼脂扩散纸片法）
３．４ 水溶性壳聚糖抑制菌机理探讨 大多数研究的结果认为，壳聚糖的抑菌能力随其
浓度增大而增强，但是Ｓｕｄａｒｓｈａｎ等［７］认为适当的低浓度 壳聚糖的抑菌能力最强。因为适当的低浓度壳聚糖可 以中和细菌细胞表面所带的负电荷，使细菌细胞胶合 在一起，而高浓度的壳聚糖可能使细菌细胞表面带上 一定数量的正电荷，从而使细菌细胞处于悬浮状态，而 不是胶合在一起。由于浓度高、黏度大不易透过细菌细胞 壁 ，因 此 认 为 其 主 要 靠 隔 断 营 养 源 而 发 挥 抑 菌作用； 低浓度的水溶性壳聚糖更容易穿透细胞壁进入细胞 内部，与细菌细胞内物质进一步作用，扰乱细菌的合成 和代谢，从而发挥其抗菌作用。
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｈｙｄｒｏｓｏｌｕｂｌｅ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｏｎ ｆｉｖｅ ｃｏｍｍｏｎ ｂａｃｔｅｒｉａ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ， Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ，Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ａｎｄ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｏｎ ｓｏｌｉｄ ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｙｄｒｏｓｏｌｕｂｌｅ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｉｎ １％ ＨＡＣ ｗａｓ ｍｕｃｈ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｗａｔｅｒ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｔｏ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓｔａｐｈｙｌｏ－ ｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ． Ｔｈｅ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｈｙｄｒｏｓｏｌｕｂｌｅ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｗａｓ ａｌｓｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｐｒｉｍａｒｉｌｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｈｙｄｒｏｓｏｌｕｂｌｅ ｃｈｉｔｏｓａｎ； ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ； ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
将Φ６ ｍｍ的圆形滤纸片放入各不同浓度的水溶性 壳聚糖溶液中一同高压蒸气灭菌（１２０℃、０．１２ ＭＰａ）。取 各种菌悬液１００μＬ均匀涂抹在培养基平皿表面，用无菌 镊子将各滤纸片贴在各种含菌平皿上，每皿贴６ 个，分 别对应于 ５种壳聚糖浓度及对照。实验壳聚糖浓度分别 为０．５％、０．２５％、０．１２５％、０．０６２５％、０．０３１２５％，并以蒸馏 水和１％的醋酸为对照，对照样除不加壳聚糖外，其他 条件与加有壳聚糖的培养基一致。每种菌种重复３次 实验，在３７℃培养２４ ｈ，测定圆滤纸片的抑菌圈直径， 结果如图１所示。
不同浓度水溶性壳聚糖溶于１％ＨＡｃ时对各供试菌 的抑菌率见表３。从表３可以看出，随着浓度的逐渐降低， 水溶性壳聚糖对各供试菌的抑菌率呈现先增后减的趋势。 在所试浓度范围内，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色 念珠菌、变形杆菌、绿脓杆菌的最高抑菌率分别为１００％、 １００％、８５％ 、７０％ 、８５％ 。 最 佳 抑 菌浓度分别为０．０６２５％、 ０．１２５％、０．０６２５％、０．５％、０．０６２５％。