结核病实验室诊断技术及应用
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吴学兵，陆彬，桂晓虹等。液体MGIT培养法在结核分枝杆菌检测中的应用评估。检验医学，2013,3（28）：211-214
二、免疫学检测
血清学检测（抗体、抗原） 结核菌素试验（灵敏度、特异性？） 结核感染T细胞检测（γ -干扰素检测）
WHO关于血清学检测声明
2011年7月20日，世界卫生组织（ WHO ）正式声明，要 求禁止将 血清学检测方法 （抗原，抗体，蛋白芯片等）用 于肺结核和肺外结核的诊断。
n r-干扰素释放实 验
n 交叉污染 n 仪器要求复杂 n 反应抑制
RNA诊断：
TMA NASBA
SAT
20世纪90年代
n 高灵敏度 n 高特异性 n 交叉污染少
一、细菌法
直接涂片
（阳性率低—5000以上细菌/ml；
不能区分真假、死活）
一、细菌法 结核菌的培养
结核病病原学诊断的金标准 (培养时间长是其软肋)
《摘自2014年中国结核病监测报告》
结核病检测技术发展历程
分子诊断时代
细菌法： 直接镜检 体外培养
19世纪中叶
n 灵敏度低 n 检测周期长 n 成本低
免疫学检测： Ab Ag PPD
T-SPOT
20世纪60年代
DNA诊断：
PCR LAMP GeneXpert 基因芯片
20世纪80年代
n 血清学检测 WHO不推荐
-
-
pasteur
-
-
环境分枝杆菌
M abcessus M avium M branderi M celatum M chelonae M fortuitum M gordonii Mintracellulare
M kansasii
M malmoense M marinum M oenavense M crofulaceum
Ø美国FDA数据：特异性97.1%(297/306) Ø国内临床数据：特异性94.1%(478/508)
• 灵敏度
基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率
Ø美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183) Ø国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655)
13
T-SPOT相关指南
Mtb16.3）制备多靶点蛋白微阵列
大量的文献报道其敏感性
特异性均显著高于涂片与培养法
可用于结核病的临床辅助诊
断，提高痰涂片和痰培养假阴性的检测率
参考文献略
γ-干扰素释放实验（IGRAs)
Interferon-Gamma Release Assays
10
结核杆菌特异抗原：ESAT-6与CFP10
•T-SPOT®.TB是采用γ-干扰素释放试验（IGRA）原理，获得
美国FDA认证、欧盟CE认证和首个中国CFDA认证的商业化 产品 •列入欧美25个国家结核诊疗指南
2011年英国NICE指南、2010年美国最新结核诊疗指南、 2010年加拿大结核指南 •美国CDC推荐—卡介苗（BCG）接种人群结核感染检测首选 • 国内风湿科和消化科已列入专家共识
污染率
液体培养 （BD MGIT960）
13.63±7.14
22.94±9.55 32.00% 9.30% 6.57%
固体培养 （罗氏L-J）
28.67±10.04
28.53±10.40 17.90% 2.60% 4.0%
液体培养在提高阳性率、缩短报阳时间上均优于固体培养。
仍然不能满足临床快速诊断的需要
一、细菌学检测的新方法 —提高阳性率
发光二极管荧光显微镜（LED） 液体培养（可同时缩短培养时间） 自动化涂片/染色技术（夹层杯法）
不能区分真假、死活；培养仍是金标准 但耗时长、
分枝杆菌固体培养与液体培养比较
疑似新发患者报阳时间 （d）
复诊患者报阳时间(d) 疑似新发患者阳性率
复诊患者阳性率
11
结核杆菌特异抗原：ESAT-6与CFP10
结核菌群
抗原
ESAT6
CFP-10
M tuberculosis +
+
M africanum
+
+
M bovis
+
+
BCG substrain
-
-
gothenburg
-
-
moreau
-
-
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
tice
-
-
tokyo
-
-
danish
-
-
glaxo
-
-
montreal
14
快速—T-SPOT的实验步骤
用BD CPT 管或Ficoll提取液收集外周 血单个核细胞
结核特异抗原（ESAT-6/CFP 10）刺激 结核特异的效应T淋巴细胞使其分泌γ干扰素
效应T淋巴细胞分泌的γ-干扰素 与膜板预包被的抗γ-干扰素抗体 结合并固定在细胞周围
过夜孵育，洗板，加入酶标二抗
ESAT-6 : 早期抗原靶6（Early Secreted Antigenic Rarget 6） CFP10 : 培养滤液蛋白10（Culture Filtrate Protein 10）
•由结核杆菌基因组RD1区相同的操 纵子编码的蛋白 •所有的卡介苗（BCG）均丢失RD1 和RD2 •绝大多数的环境分枝杆菌(NTM)也 不存在RD1和RD2区
WHO warns against the use of inaccurate commercial serological tests for pulmonary and extra-pulmonary TB.
蛋白质组学的发展
3、4、7种结核杆菌优势表位抗原
（16KD、38KD、MPT64、ESAT-6、CFP10、Mtb8、Mtb8.4、
结核病实验室诊断技术及应用
全球范围内结核病疫情急剧恶化 全球1/3人口（约20亿）已感染了结核菌， 人口的大规模流动 结核病与艾滋病同时流行 结核菌耐多药菌株的出现 我国是世界上仅低于印度和印尼的第三结核病大国 患病率高， 新发患者93万/年，结核菌感染率为约40％ 死亡率高，每年死亡人数达13万 耐药率高 早期快速诊断与治疗成为制约结核病防控的关键因素 常规结核病实验室检测方法诊断阳性率不到60％。
M smegmatis
M szulgai M terrae M vaccae M xenopi
抗原
ESAT6
+ + + + -
CFP-10
+ + + + -
12
准确—T-SPOT临床诊断性能
• 特异性
阴性预测值：93.9%（478/509） 阳性预测值：95.4%（624/654）
只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（ BCG）无交叉反应
二、免疫学检测
血清学检测（抗体、抗原） 结核菌素试验（灵敏度、特异性？） 结核感染T细胞检测（γ -干扰素检测）
WHO关于血清学检测声明
2011年7月20日，世界卫生组织（ WHO ）正式声明，要 求禁止将 血清学检测方法 （抗原，抗体，蛋白芯片等）用 于肺结核和肺外结核的诊断。
n r-干扰素释放实 验
n 交叉污染 n 仪器要求复杂 n 反应抑制
RNA诊断：
TMA NASBA
SAT
20世纪90年代
n 高灵敏度 n 高特异性 n 交叉污染少
一、细菌法
直接涂片
（阳性率低—5000以上细菌/ml；
不能区分真假、死活）
一、细菌法 结核菌的培养
结核病病原学诊断的金标准 (培养时间长是其软肋)
《摘自2014年中国结核病监测报告》
结核病检测技术发展历程
分子诊断时代
细菌法： 直接镜检 体外培养
19世纪中叶
n 灵敏度低 n 检测周期长 n 成本低
免疫学检测： Ab Ag PPD
T-SPOT
20世纪60年代
DNA诊断：
PCR LAMP GeneXpert 基因芯片
20世纪80年代
n 血清学检测 WHO不推荐
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pasteur
-
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环境分枝杆菌
M abcessus M avium M branderi M celatum M chelonae M fortuitum M gordonii Mintracellulare
M kansasii
M malmoense M marinum M oenavense M crofulaceum
Ø美国FDA数据：特异性97.1%(297/306) Ø国内临床数据：特异性94.1%(478/508)
• 灵敏度
基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率
Ø美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183) Ø国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655)
13
T-SPOT相关指南
Mtb16.3）制备多靶点蛋白微阵列
大量的文献报道其敏感性
特异性均显著高于涂片与培养法
可用于结核病的临床辅助诊
断，提高痰涂片和痰培养假阴性的检测率
参考文献略
γ-干扰素释放实验（IGRAs)
Interferon-Gamma Release Assays
10
结核杆菌特异抗原：ESAT-6与CFP10
•T-SPOT®.TB是采用γ-干扰素释放试验（IGRA）原理，获得
美国FDA认证、欧盟CE认证和首个中国CFDA认证的商业化 产品 •列入欧美25个国家结核诊疗指南
2011年英国NICE指南、2010年美国最新结核诊疗指南、 2010年加拿大结核指南 •美国CDC推荐—卡介苗（BCG）接种人群结核感染检测首选 • 国内风湿科和消化科已列入专家共识
污染率
液体培养 （BD MGIT960）
13.63±7.14
22.94±9.55 32.00% 9.30% 6.57%
固体培养 （罗氏L-J）
28.67±10.04
28.53±10.40 17.90% 2.60% 4.0%
液体培养在提高阳性率、缩短报阳时间上均优于固体培养。
仍然不能满足临床快速诊断的需要
一、细菌学检测的新方法 —提高阳性率
发光二极管荧光显微镜（LED） 液体培养（可同时缩短培养时间） 自动化涂片/染色技术（夹层杯法）
不能区分真假、死活；培养仍是金标准 但耗时长、
分枝杆菌固体培养与液体培养比较
疑似新发患者报阳时间 （d）
复诊患者报阳时间(d) 疑似新发患者阳性率
复诊患者阳性率
11
结核杆菌特异抗原：ESAT-6与CFP10
结核菌群
抗原
ESAT6
CFP-10
M tuberculosis +
+
M africanum
+
+
M bovis
+
+
BCG substrain
-
-
gothenburg
-
-
moreau
-
-
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
tice
-
-
tokyo
-
-
danish
-
-
glaxo
-
-
montreal
14
快速—T-SPOT的实验步骤
用BD CPT 管或Ficoll提取液收集外周 血单个核细胞
结核特异抗原（ESAT-6/CFP 10）刺激 结核特异的效应T淋巴细胞使其分泌γ干扰素
效应T淋巴细胞分泌的γ-干扰素 与膜板预包被的抗γ-干扰素抗体 结合并固定在细胞周围
过夜孵育，洗板，加入酶标二抗
ESAT-6 : 早期抗原靶6（Early Secreted Antigenic Rarget 6） CFP10 : 培养滤液蛋白10（Culture Filtrate Protein 10）
•由结核杆菌基因组RD1区相同的操 纵子编码的蛋白 •所有的卡介苗（BCG）均丢失RD1 和RD2 •绝大多数的环境分枝杆菌(NTM)也 不存在RD1和RD2区
WHO warns against the use of inaccurate commercial serological tests for pulmonary and extra-pulmonary TB.
蛋白质组学的发展
3、4、7种结核杆菌优势表位抗原
（16KD、38KD、MPT64、ESAT-6、CFP10、Mtb8、Mtb8.4、
结核病实验室诊断技术及应用
全球范围内结核病疫情急剧恶化 全球1/3人口（约20亿）已感染了结核菌， 人口的大规模流动 结核病与艾滋病同时流行 结核菌耐多药菌株的出现 我国是世界上仅低于印度和印尼的第三结核病大国 患病率高， 新发患者93万/年，结核菌感染率为约40％ 死亡率高，每年死亡人数达13万 耐药率高 早期快速诊断与治疗成为制约结核病防控的关键因素 常规结核病实验室检测方法诊断阳性率不到60％。
M smegmatis
M szulgai M terrae M vaccae M xenopi
抗原
ESAT6
+ + + + -
CFP-10
+ + + + -
12
准确—T-SPOT临床诊断性能
• 特异性
阴性预测值：93.9%（478/509） 阳性预测值：95.4%（624/654）
只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（ BCG）无交叉反应