基因工程 考试 重点 噬菌体载体

第二章 DNA重组克隆的单元操作
练习题
噬菌体载体(练习题)
一、填空题
1．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是；二是。

2．第一个报道的全测序的单链DNA 噬菌体是φX174，DNA 长5386 个碱基对，共个基因，为一环状DNA 分子，基因组的最大特点是。

3．λ噬菌体的基因组DNA 为kb，有多个基因。

在体内，它有两种复制方式，扩增时(早期复制)按复制，成熟包装(晚期复制)则是按复制。

它有一个复制起点，进行向复制。

λ噬菌体的DNA 既可以以线性存在又可以环状形式存在，并且能够自然成环。

其原因主要是在λ噬菌体线性DNA 分子的两端各有一个个碱基组成的天然黏性末端。

这种黏性末端可以自然成环。

成环后的黏性末端部位就叫做位点。

4．根据噬菌体的包装能力，将野生型λ噬菌体的基因组DNA 改造成插入型载体，该载体的最小分子大小约为kb，插入的外源片段最大不超过kb。

5．野生型的M13 不适合用作基因工程载体，主要原因是和。

6．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自、COS 位点序列来
自，最大的克隆片段达到kb。

7．有两类改造型的λ噬菌体载体，即插入型和取代型。

从酶切点看，插入型为个，取代型为个。

8．野生型的丸噬菌体DNA 不宜作为基因工程载体，原因是：(1) (2) (3) 。

9．M13 单链噬菌体的复制分为三个阶段：(1) (2) (3) 。

10．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA 共同构成的，其中来自质粒的主要结构是，而来自噬菌体的主要结构是。

11 ．M13 单链噬菌体基因2 和基因4 之间的IG 区有三个最重要的功能，即(1)
(2) (3) 。

12．野生型的M13 有10 个基因，分为三个功能集团，其中与复制有关的两个基因是：和。

13．以λ噬菌体载体和黏粒载体构建文库时，起始DNA 的长度是不同的，前者为
kb，后者为kb。

14．λ噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA 片段后，总的长度应在噬菌体基因组的的范围内。

二、判断题
1. 取代型载体(replacement vector)是指同一种限制性内切核酸酶在),DNA 中具有两个切
点，外源DNA 通过取代这两个切点间的片段被克隆。

2. 现在最常用的pUC 载体是pUCl8,它的分子量小，具有多克隆位点和易于选择的分子标记，并且是松弛型复制。

另外，这种载体可在辅助质粒的帮助下合成单链DNA。

3. 噬菌粒(phagemid)pUCll8／pUCll9 载体是集质粒和丝状噬菌体有利特征于一身的载体，既能合成单链DNA,又能合成双链DNA。

4. λ噬菌体DNA 和M13 单链噬菌体DNA 在成熟前的DNA 复制都是用滚环模型。

5. M13 噬菌体每个世代裂解宿主后，可释放100 个子代噬菌体。

6. 以黏粒为载体的重组体虽然在平板上生长的速度不同，但是转化子中插入片段的扩增量
是相同的。

三、选择题(单选或多选)
1. 限制性内切核酸酶EcoRI 在野生型的丸噬菌体DNA 中有5 个切点、Hind Ⅲ有7 个切点，BamH I 也有5 个切点。

调整这些酶切位点的数量，主要通过( )
(a)体内突变(b)完全酶切后连接
(c)部分酶切(d)先用甲基化酶修饰后再酶切
2. PBluescript Ml3 载体在多克隆位点的两侧引入了T7 和T3 两个噬菌体的启动子，这样
增加了该载体的功能，如：
(a) 可以对插入到多克隆位点的外源片段进行转录分析
(b) 利用这两个启动子的通用引物进行PCR 扩增
(c) 利用通用引物进行序列分析
(d) 利用这两个启动子进行定点突变
上述四种功能中哪一种是不正确的?( )
3. 下面关于细菌人工染色体(BAC)的特征描述，除了( C )外都是正确的。

(a) 通过电激法将大质粒转化大肠杆菌比酵母的转化率提高了10—100 倍
(b) BAC 载体在细菌中以环形超螺旋状态存在，使分离操作起来相对容易
(c) BAC 载体在大肠杆菌宿主保持高拷贝
(d) 克隆到BAC 载体上的外源片段可以直接进行测序以获得末端序列
4. 以黏粒为载体转染受体菌后，平板上生长的菌落会大小不一、生长速度不一的现象，其原因是( )
(a) 营养成分不足
(b) 重组后的质粒复制不稳定
(c) 重组后的黏粒整合到宿主染色体上
(d) 重组体中插入片段的大小不同
5. M13K07 是一种辅助噬菌体DNA,可用它帮助噬菌粒制备单链DNA,这是因为( )
(a) M13K07 能够进行滚环复制，得到大量的单链噬菌体DNA
(b) M13K07 能够提供成熟包装的蛋白
(c) M13K07 提供了成熟包装所需的信号
(d) M13K07 的10 个基因都是正常的
6. 黏粒(cosmid)是一种人工建造的载体，( )
(a) 它具有COS 位点，因而可进行体外包装
(b) 它具有质粒DNA 的复制特性
(c) 进入受体细胞后，可引起裂解反应
(d) 进入受体细胞后，可引起溶源化反应
7．Mu 噬菌体也是一种转座元件，这种转座元件( )
（a）可引起寄主的突变
（b）可用于细胞内的基因工程
（c）具有转座酶基因
（d）以上说法都正确
8．关于M13 的IGIX,下列说法中哪一项不妥当?( )
(a) 具有正负链的复制起点
(b) 具有噬菌体DNA 被包装的信号
(c) 具有150 个碱基的AT 富集区
(d) 具有八个回文序列，可形成五个发夹环
9. M13 噬菌体基因组编码10 个基因，在它的成熟过程中起调节作用的蛋白是( )
（a）gp2 蛋白(b)gp5 蛋白(c)gp7 蛋白(d)gp9 蛋白
四、简答题
1．在转导过程中，通常需要把受体菌和在供体中生长的噬菌体悬浮液分别铺在选择性培养基上，为什么?
2．如何将野生型的九噬菌体改造成为一个理想的载体?
3．用Sal I 切割从噬菌体J2 分离的DNA 时，得到8 个片段，分别是：1.3、2.8、3.6、5.3、7.4、7.6、8.1 和11.4kb。

但是，用SaI I 切割从被感染的寄主细胞中分离到的J2 噬菌体DNA 时，只得到7 个片段，分别是:1.3、2.8、7.4、7.6、8.1、8.9 和11.4kb，根据这些
结果，您得到哪些信息?
4．在cⅠ基因正常时为什么也会出现浑浊的噬菌斑?不正常则是清亮的噬菌斑?
5．λ噬菌体DNA 被包装到噬菌体的头部，需要哪些基本条件?为什么?
五、问答题
1．为什么野生型的λ噬菌体DNA 不宜作为基因工程载体?
2．什么是蓝白斑筛选法?
3．蓝白斑筛选法为什么也会有假阳性?
4．什么是c I 筛选法?
5．λ噬菌体载体具有哪些优点与不足?
6．什么是M13 的IG 序列区?有何特点和功能?
7．将野生型的M13 改造成基因工程载体，首先是进行酶切位点的改造，请问M13 中的EcoRⅠ最初是如何引入的？
8．以置换型λ噬菌体作为载体进行克隆时，为什么说能够形成噬菌斑的就一定是重组体？9．M13 系列载体具有哪些优缺点？
10．黏粒载体具有哪些特点与不足？
11．辅助噬菌体DNA 和相应的噬菌粒是如何协同工作的？
噬菌体载体(参考答案)
一、填空题
1．它在细菌中能够大量繁殖，这样有利于外源DNA 的扩增；对某些噬菌体(如λ噬菌体) 的遗传结构和功能研究得比较清楚，其大肠杆菌宿主系统的遗传也研究得比较详尽2．10；基因的重叠
3．48．5；60；凯恩斯模型；滚环；双；12；COS
4．36；14
5．没有合适的限制性内切核酸酶识别位点；选择标记
6．质粒；丸噬菌体；45
7．1；2
8．(1)分子量大，(2)酶的多切点，(3)无选择标记
9．(1)SS---~RF；(2)RF---~RF；(3)RF-*SS
10．复制区；IG 区
11．(1)正链复制起点；(2)负链复制起点；(3)包装信号
12．基因Ⅱ；基因Ⅴ
13．100kb；200kb
14．75％一105％
二、判断题
1．错误。

不一定是同一种酶，如果两种不同的限制性内切核酸酶在载体上各只有一个切点，两切点间的片段被取代后又不影响噬菌体的生活力，也是取代型载体。

2．错误。

pUCl8 没有IG 区，不可能形成单链。

3．错误。

如果没有助手噬菌体的存在，则不能形成单链DNA。

4．正确。

5．错误。

M13 噬菌体不会使宿主裂解，导致噬菌体从细胞释放出来。

6．错误。

由于重组体在乎板上生长的速度不同，转化子中插入片段的扩增量就不相同，三、选择题(单选或多选)
1．a；2．d；3．c；4．d；5．d；
6．a，b，c；7．d；8．d；9．b
四、简答题
1．答：
这些平板起对照作用。

第一个对照实验可检测和估计自发突变为野生型的频率；第二
个对照实验确证噬菌体悬液中无菌情况(即不能有任何活的供体细菌)。

2．答：
(1)削减分子量(除去非必需区和整合区)；(2)削减酶切位点；(3)添加选择标记；
(4)引入终止突变
3．答：
(1)J2 噬菌体是一种双链线性的DNA 分子；(2)基因组全长是47．5kb；(3)进入宿主
后成环状；(4)5．3 和3．6kb 的片段分别位于线性DNA 的两端。

4．答：
正常时，既有裂解途径也有溶源化途径。

不正常则全部进入裂解途径。

5．答：
(1)两个COS 位点；(2)线性DNA；(3)大小在丸噬菌体基因组的75％一105％的范
围之内。

五、问答题
1．答：
(1)噬菌体DNA 没有容载能力，因为噬菌体的头部对DNA 包装的量是有限制的，
不能大于基因组的105％，所以要将λ噬菌体改造成载体，必须削减分子量。

(2)野生型的λDNA 对于一些常用的酶都有多个识别和切割位点，不便于克隆。

(3)没有可供选择的标记。

(4)野生型的λ噬菌体具有感染性，因此不够安全。

2．答：
这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。

主要是在λ载体的非必要区插入一
个带有大肠杆菌β—半乳糖苷酶的基因片段，携带有lac 基因片段的λ载体转入lac—
的宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成浅
蓝色的噬菌斑。

外源基因插入lac(或lac 基因部分被取代)后，重组的噬菌体将丧失分解
X-gal 的能力，转人lac—的宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳
糖苷(X-gal)平板上形成白色的噬菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。

3．答：
β—半乳糖苷酶的N 末端是非必需的，可以进行修饰，并不影响酶的活性或。

肽的互
补性。

如果插入的外源DNA 引起。

肽的可读框的改变，或者插入片段在正确的可读框
中含有终止密码的话，就会形成白色噬菌斑。

如果插入DNA 的碱基数正好是3 的倍数，或者插入的DNA 中不含有终止密码的话，仍然会形成蓝色噬菌斑。

这种插人物的长度
可达几百个碱基对。

M13 载体的这种性质可以用来检测和选择产
生新的终止密码或改变可读框，即移码突变。

4．答：
CⅠ基因的功能是促使噬菌体进入溶源化，但在正常情况下，它的噬菌斑是不清楚
的，有点浑浊。

这是因为在λ噬菌体感染时，有少数细胞进入溶源化途径，这些细
胞生长在噬菌斑中，就造成了噬菌斑浑浊。

由于cⅠ基因的产物——阻遏物的失活，
不会有溶源菌的形成，因此，形成的噬菌斑都是清亮的，很容易将重组体与非重组体区别开来。

c I 阻遏物的名字就是指在该基因中插入一段DNA 后会使噬菌斑的形态变得清亮(c=clear)。

5．答：
优点：
(1)λ基因组中有1／3 的非必需区，可以被置换，改造成载体后，克隆的片段较大(可达20kb)，而质粒载体的克隆片段只有几个kb；
(2)用噬菌体DNA 作为载体，即使不进行体外包装，转染的频率也比质粒转化的
效率高，包装后的效率就更高了；
(3)λ可通过溶源化反应整合到寄主染色体上，当不需要外源基因大量表达时，可让
它以溶源性存在，若要表达，可通过诱导即可进入裂解途径，释放出大量的噬菌体，得到的重组DNA 的拷贝数就会很多。

不足：
(1)需要包装比较麻烦，包装率又不稳定，购买包装蛋白的费用又高；
(2)没有质粒的用途广泛。

6．答：
在M13 基因组中的基因2 与基因4 之间有一个长度为507 个核苷酸的基因区间，简
称IG(intergenic region)，占基因组的8％。

该区具有以下特点：
(1)具有正、负链的复制起点；
(2)具有噬菌体DNA 被包装到噬菌体颗粒的包装信号；
(3)具有150 个碱基的AT 富集区；
(4)有5 个回文序列，能够形成5 个发夹环，回文序列A 是包装信号。

IG 区在M13 噬菌体的生命周期中的4 个过程中起重要作用：
(1)噬菌体DNA 成熟包装到噬菌体颗粒中的包装识别位点；
(2)RNA 引物合成的位点，合成的引物用于(一)链的合成；
(3)(＋)链合成的起始位点，全长140bp,分成两个结构域，结构域A 长为40bp,是复
制起始的基本位点，它被gp2 识别，产生一个切口开始复制，并作为复制的终
止点。

结构域B 长为100bp，起增强子作用，帮助gp2 在结构域A 起作用。

(4)(＋)链合成的终止位点。

7．答：
用识别4 个碱基的限制酶HaeⅢ切割M13 双链DNA，发现HaeⅢ在M13 上有10
个切点。

为了将M13 构建成克隆载体，首先用HaeⅢ将RFl 进行部分消化，使之
产生单一切点的全长的线性M13DNA。

HaeⅢ在M13 上有10 个切点，因此产生的线性DNA 的末端可能是这10 个切点的
任何一个部位产生的。

将外源DNA 同线性的M13DNA 连接起来，只有在非必需
区插入并连接起来的重组体能够进行复制，从必需区插入的重组DNA 不能复制，
因此将会被丢失。

根据上述的原理，用HaeⅢ部分酶切野生型的RFMl3DNA,然后同lac 插人片段连
接，感染后筛选重组体M13mpl，该重组体中的插入片段是从IG 区的5868 位的
HaeⅢ位点插入的。

通过对lac 插入片段的序列分析发现，只要将β半乳糖苷酶基因内的密码子5 的碱
基G 换成A 即可产生一个EcoRI 的识别位点(G AATTC)。

因为知道G 中的06 甲基化将会导致G 同U 的配对，将单链的M13mpl 的(+)链用
甲基化试剂N—甲基—N—亚硝酸脲进行处理，用突变的DNA 去转染细菌，分离RF 型DNA，由于分离的RF DNA 并非都具有EcoRI 位点的突变体，所以用EcoRI
切割后，通过琼脂糖凝胶电泳进行检查，根据线性DNA 与环状DNA 的电泳迁移
率的不同，将线性化的DNA 分离出来，重新连接成环，再进行转染。

分离到三个
克隆，每个克隆都有一个EcoRI 的位点，但所在位置有所不同，将它们分别命名
为：M13mp2、M13mp3、M13mp4。

8．答：
改造的置换型噬菌体载体，重组人外源片段之后，总体积不能超过λ基因组的105％，不能少于λ基因组的75％。

以置换型λ噬菌体DNA 作为载体，首先要分离左、右两臂同外源DNA 重组。

如果没有外源片段，仅是两臂连接，长度短于λ基因组的75％，不能被包入噬菌体颗粒，就不能感染寄主，也就不能形成噬菌斑。

如果插入了外源片段后，总长度超过丸基因组105％后，也不能包入噬菌体颗粒，自然不能形成噬菌斑。

9．答
M13 克隆系统具有很多优点：
(1)克隆的片段大：M13 噬菌体的DNA 在包装时不受体积的限制，所以容载能力
大，有报道，有些噬菌体颗粒可以包装比野生型丝状噬菌体DNA 长6～7 倍的
DNA(插入片段可达40kb)。

(2)可直接产生单链DNA，这对于DNA 测序、DNA 诱变、制备特异的单链DNA
探针都是十分有用的。

(3)单链DNA 和双链DNA 都可以转染宿主，并可根据人工加上的选择标记进行筛
选。

M13 克隆系列的不足：
(1)较大的外源片段插入后，在扩增过程中往往不够稳定，一般说，克隆的片段越
大，发生丢失的机率越大。

(2)单链载体分子感染的细胞中，往往是单链和双链混杂，分离双链比较麻烦。

10．答：
主要特点有：
(1)具有质粒复制子，进入寄主细胞后能够像质粒一样进行复制，并且能够被氯霉
素扩增。

(2)具有质粒载体的抗生素抗性基因的选择标记。

(3)具有λ噬菌体的包装和转导特性。

(4)容载能力大。

克隆的最大片段在45kb，最小片段为19kb。

(5)简化了筛选。

如果载体的分子量在5kb 的话，得到的转导子几乎排除由载体自
连的可能性，因为要被成功包装，至少要7 个分子的载体自连，尽管如此，也是
不能被包装的，因为COS 位点太多了。

黏粒载体也有如下不足：
(1)如果两个黏粒之间有同源序列，可能会发生重组，结果会使被克隆的片段重排或
丢失。

(2)含不同重组DNA 片段的菌落生长速度不同，会造成同一个平板上菌落大小不
一。

另外由于不同大小的插入片段对宿主细胞的作用不同，会造成文库扩增量
的比例失调。

(3)包装过程复杂，包装效率不稳定，代价高。

11．答：
虽然噬菌粒载体携带有M13 的IG 区，能够合成单链DNA，但是它没有M13 的功能基因，没有M13 基因2 的产物存在，所以不能合成单链DNA。

而辅助噬菌体具有M13 的所有功能基因，但是IG 区是缺陷的，辅助噬菌体本身的DNA 不能进行单链复制，于是就可以为噬菌粒提供基因2 产物和包装蛋白。

辅助噬菌体必需具备如下条件：
(1)辅助噬菌体的DNA IG 区必需失去功能，其本身的DNA 不会被包装到成熟的
噬菌体颗粒中；
(2)由于辅助噬菌体的IG 区失活，其本身的基因不能表达，要使辅助噬菌体的所
有功能基因都能进行表达，必须在辅助噬菌体的基因组中导人新的复制起点；(3)辅助噬菌体的基因组中具有选择标记，便于识别和收集一定数量的辅助噬菌体。