第11章 随机扩增多态DNA的方法和应用

第11章 随机扩增多态DNA的方法和应用

DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。1990年，Williams和 Welsh 等人运用随机引物扩增寻找的多态性 DNA 片段作为分子标记，并将此方法命名为 RAPD（random amplified polymorphic DNA），即随机扩增多态性 DNA（Williams等 1990；Welsh等 1990）。尽管RAPD技术诞生的时间不长，但由于其独到的DNA多态性以及快速、简便等特点，使它成为目前基因组遗传图谱构建、基因定位及生物进化和分类的重要手段之一。本文将对RAPD技术的基本原理和特点、基本操作程序以及RAPD技术在检测物种遗传多样性中的应用作一简单的介绍。

11.1 RAPD技术的原理和特点

RAPD技术建立在PCR技术的基础上，它是利用一系列随机排列的寡核苷酸（通常为十聚体）为引物，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增。扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后，经EB染色或放射自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性，这些扩增 DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。

RAPD所用的一系列引物各不相同，但对于任一特定的引物来说，它同基因组DNA序列有其特定的结合位点。这些特定的结合位点在基因组的某些区域内的分布如符合PCR扩增条件，即引物在模板的两条链上有互补位置，且引物的3端相距在一定长度范围之内，就可扩增出片段。因此，如果基因组在这些区域发生DNA片段的插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些结合位点的分布发生相应的变化。通过对 PCR产物的检测即可探知基因组 DNA在这些区域内的多态性。

进行RAPD分析时可用引物数很多，虽然对每一个引物而言，其检测基因组DNA多态 性的区域是有限的，但利用一系列引物则可使检测区域覆盖整个基因组。因此，RAPD可以 对整个基因组进行多态性检测。

RAPD技术与其他DNA多态性检测技术如RFLP（restriction fragment length polymorphism）、DNA指纹图（DNA finger-printing）、SSCP（singer-strind conformatation polymorphism）等相比，还具有以下几个特点：①RAPD技术可以在对受试物种（包括动物、植物和微生物）缺乏任何分子生物学研究的背景下，直接对基因组进行多态性分析；②操作简便，一次RAPD扩增实际上就是一次简单的PCR反应，适合大量样本的快速分析；③所需模板DNA量极少，一般一次扩增只需5～50ng的DNA。因此可以从毛发、脱落组织甚至动物的排泄物中提取微量DNA进行直接扩增。这对于珍稀濒危动物和价值很高的种畜、禽的基因组分析是十分有效的（王文等 1994；陈永久等 1997，1998；Gwakisa等 1994；Yi 1995；

本章作者：陈永久，魏 伟，史宪伟，张亚平

第11章随机扩增多态DNA的方法和应用 131

Tibayrenc等 1993；Wachira 1995）。

11.2 RAPD的基本操作方法

RAPD的操作方法大体上包括DNA提取、扩增、电泳和染色等几个主要步骤。具体的操作过程见 Williams等（1990，1993）和 Welsh等（1990）的论述。随着 RAPD技术的发展，该技术也作了一些改动（Bucci，Menozzi 1993；Dawson等1993；Lawson等1994）。

11.2.1 RAPD模板的制备

11.2.l.1 动物组织总 DNA的提取

取新鲜动物组织材料，如肝脏、肾脏或肌肉等10～100mg，剪碎后加入750µl的STE （0.1mol／dm3NaCl，20mmol／dm3EDTA，10mmol／dm3Tris-HCl，pH值 8.0）、80µl 10％SDS 和8µl 20mg／ml的蛋白酶K。在56℃下消化12～24／小时后，用酚、氯仿、异戊醇（25:24: 1）和氯仿－异戊醇（24:1）分别抽提一次。每次抽提时间为12～24小时。上清液用等体积 的异丙醇沉淀及70％的乙醇清洗。沉淀干燥后，用适量的TE溶解，置于4℃冰箱中备用。

11.2.1.2 植物及其真菌的总DNA提取

取50～500mg植物或真菌的新鲜材料，分别经95％的乙醇、70％的乙醇和超净水清洗。将材料剪碎后，在材料中加入700µl十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）提取液（2％CTAB， 1.4mol／dm3NaCl，0.2％ 2-巯基乙醇，20mmol／dm3EDTA，100mmol／dm3Tris-HCl，pH值8.0）。在56℃下消化12～24小时。用酚、酚－氯仿－异戊醇（25:24:1）和氯仿－异戊醇（24:1）分别抽提一次，每次抽提时间为12～24小时。将上清液用等体积的异丙醇沉淀后，用70％的乙醇清洗。沉淀干燥后，用适量的TE溶解，然后置于 4℃冰箱中备用。

12.2.2 RAPD反应体系

11.2.2.1 RAPD反应的仪器和试剂

用于 RAPD扩增的实验仪器主要是一台 PCR扩增仪。由于 RAPD反应中的引物和模板 之间的结合是随机的，因此我们建议使用一台固定的PCR扩增仪进行RAPD反应。

RAPD反应的试剂有：①PCR缓冲液，各家公司生产的TaqDNA酶均配有相应的缓冲液；② dNTP，包括 dATP，dGTP，dCTP和dTTP 4种，每种浓度为25mmol／dm3 ；③MgCl2 25mmol／dm3；④随机引物，美国Opren公司生产800种随机引物，其他一些公司也有生产；⑤牛血清白蛋白（BSA）10mg／ml，或明胶 0.01％；③TaqDNA聚合酶。

11.2.2.2 RAPD的PCR体系

PCR体系可以是10µl、20µl、25µl、50µl或100µl。反应体系中各成分的浓度为：①随机引物，通常为10对碱基组成，其中G＋C％为50％～70％，用于RAPD的引物浓度为0.2µmol／dm3；②dNTP（包括dATP，dGTP，dCTP，dTTP）；用于RAPD反应的每种dNTP