酿酒酵母的发酵过程优化

酿酒酵母的发酵过程优化
摘要：分批培养是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量微生物菌种进行培养，使微生物生长繁殖，在特定条件下完成一个生长周期的微生物培养方法。

补料分批培养则是在培养过程中间歇或连续的添加新鲜培养基。

本次实验分别通过补料分批培养与分批培养，测定相应的pH值、溶氧量、生物量、残糖量等，并比较分批培养和分批补料培养酵母细胞发酵过程的过程规律，从而达到优化酵母的发酵过程的目的。

关键字：分批培养；补料分批培养；酵母发酵过程
Optimiztion of the yeast fermentation process
Mo Xiaoyu
(Changshu Institute of Technology Jiangsu Province Changshu 215500 )
Abstract：Batch culture is a method to culture microorganism by put limited nutrient substance into closed-system.Then access to culture a few microorganism strains, make microbes grow, let them to complete a growth cycle of microorganism training method in particular conditions. Fed-batch cultivation is a method to culture microorganism by adding fresh medium in the process of cultivation intermittently or continuously.
This experiment was through the batch culture and fed-batch cultivation,determination of the corresponding pH value, oxygen, biomass, residual sugar content, and more partial training and fed-batch culture training yeast cells of the fermentation process rules, so as to optimize the yeast fermentation process.
Keywords：batch culture; fed-batch cultivation; yeast fermentation process
酵母菌为单细胞微生物，属真菌类。

从酵母菌分类系统来讲属于真酵母属。

酿酒酵母具有安全性好，高产量和高的抑制剂耐受性等优点，故一直在生物乙醇工业中有重要作用[1]。

通常以出芽繁殖。

繁殖速度较霉菌快，与原生动物不同，有坚韧的细胞壁，菌体比细菌大且形态复杂。

繁殖时有的能进行二等份分裂，有的种类能产生于囊孢子。

其形态因培养基种类及培养时间的长短而异，分别为圆形、卵形、椭圆形或腊肠形等，内有细胞核、液泡和颗粒物质[2]。

酵母菌在自然界分布甚广，为发酵工业酿酒酵母为兼性厌氧型微生物，利用酵母菌发酵生产工业乙醇具有辽阔的应用前景。

发酵培养基是酿酒酵母营养和能量的来源，其组分在发酵过程中无疑起着更为关键的作用[3]。

从普通酿酒酵母菌株的营养条件出发进行研究，在其他的条件均相同的情况下，通过分批培养与补料分批培养（补料分批培养在培养至残糖量最低时进行补料）培养相同的普通酵母菌株。

由于在分批培养中菌体生长无法控制，容易有副产物形成，因而影响发酵产率。

补料培养在有效地利用原料、减少副产物、提高产物生产水平方面均有显著的效果，而且也是生产中比较切实可行的方法[4]。

通过发酵培养过程中得到的pH值、溶氧量、生物量、残糖量等数据，进行处理与分析，以期得到优化酿酒酵母发酵过程的方法。

1材料与方法
1.1菌种
实验室自备的酿酒酵母
1.2 培养基
PDA（斜面、平板培养基）：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，水1000ml，自然pH。

制法：马铃薯去皮后，切成小块，加水煮烂（煮沸20-30min，能被玻璃棒戳破即可），用4层纱布过滤，再加糖和琼脂，加热溶化后在补足水分至1000 ml，121℃灭菌20min。

种子培养基（YEPD培养基）：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH6.0，121℃湿热灭菌20min。

发酵培养基：YEPD培养基。

酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH6.0，121℃湿热灭菌20min。

1.3仪器与设备
发酵罐、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管架、电子天平，烧杯，锥形瓶，量筒，试管，玻璃棒，培养皿，移液管、注射器（取样用）、离心管等。

1.4试剂
3，5-二硝基水杨酸等。

1.5方法
1.5.1 培养基配制、分装和灭菌
1.5.1.1 配制PDA培养基，121℃灭菌20min，倒无菌平板活化菌种。

配制YEPD培养基，并进行分装灭菌。

1.5.1.2 10ml培养基分装到50ml三角瓶中（培养一级种子），20ml培养基分装到100ml三角瓶中，（培养二级种子，作为分批培养种子液）。

20ml培养基分装到100ml三角瓶中，（培养二级种子，作为补料分批培养种子液）。

121℃灭菌20min。

1.5.1.3 发酵罐培养基分装及灭菌
将发酵罐中加入2000ml培养基，盖好盖子，pH电极、溶氧电极等经校正后插入发酵罐中，取样口、进气口用牛皮纸扎好，用夹子把每个直通液面以下的管子夹紧，121℃灭菌20min。

1.5.2 玻璃器皿包装及灭菌
将培养皿、移液管包装好121℃灭菌20min。

1.5.3 种子液的制备
自斜面菌种挑取酵母菌体，接入装有10 ml培养基的50ml三角瓶中，30℃，180r/min培养18h。

将上述培养好的种子液分别接入两个装有20ml培养基的100ml三角瓶中，接种量10%，30℃，180r/min培养18h。

1.5.4 接种
将培养好的种子液以10%（v/v）接种量接种到发酵罐培养基中，180r/min，30℃培养48h，调节通气量为3L/min。

1.5.5 实时监测pH和溶氧量
从发酵开始，每隔2h在线读取发酵罐中发酵液pH，及溶解氧量。

1.5.6 补料
在细胞生长的对数生长期中后期一次性添加20g葡萄糖到发酵罐中。

1.5.7 葡萄糖标准曲线的测定
葡萄糖标准曲线的测定用DNS法。

3,5-二硝基水杨酸试剂：
甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2ml10%氢氧化钠溶液中，并用水稀释至69ml，在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。

乙液：称取255g酒石酸钾钠加到300ml10%氢氧化钠溶液中，再加入880ml1%3,5二硝基水杨酸溶液。

将甲乙二溶液混合既得黄色试剂，储于棕色瓶中备用。

在室温放置7-10天以后使用。

葡萄糖标准溶液的配制：
准确称取100mg分析纯的无水葡萄糖（预先在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定
量转移到100ml容量瓶中，再定容到刻度，摇匀。

浓度为1mg/ml。

取9支25mm×250mm的试管，分别按下表加入试剂：
将各管溶液混合均匀，在沸水浴中加热5分钟，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5ml蒸馏水，摇匀。

于520nm波长处测A值。

以葡萄糖mg数为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

项目0 1 2 3 4 5 6 7 8
葡萄糖标准液（ml）
相当于葡萄糖量（mg）
蒸馏水（ml）
3,5-二硝基水杨酸试剂（ml）0
2.0
1.5
0.2
0.2
1.8
1.5
0.4
0.4
1.6
1.5
0.6
0.6
1.4
1.5
0.8
0.8
1.2
1.5
1.0
1.0
1.0
1.5
1.2
1.2
0.8
1.5
1.4
1.4
0.6
1.5
1.6
1.6
0.4
1.5
1.5.8生物量测定（重量法）
取发酵液10ml，3000r/min离心10min,弃上清液，湿菌泥在80℃下干燥24 h后称量。

发酵过程中每隔2 h取出10ml发酵液测定生物量和残糖量。

取样时间分别为0h，2h，4h，6h，8h，10h，12h，14h。

2 结果与分析
2.1 分批培养
2.1.1 发酵液pH随时间变化曲线
图1 分批培养中发酵液pH随时间变化曲线
Fig 1 partial in the cultivation of fermented liquid pH change over time curve
2.1.2 残糖量的测定
2.1.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制
表1 分批培养中葡萄糖标准曲线数据表
Table 1 Partial in the cultivation of glucose standard curve data tables
葡萄糖浓度(mg/mL) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 A520 0.101 0.235 0.42 0.561 0.735 0.883 0.944 0.984
图2 分批培养的葡萄糖标准曲线
Fig 2 partial training of glucose standard curve
2.1.2.2 残糖量的计算
根据标准曲线的公式计算出残糖量
根据公式y=1.3439x+0.0031,将A520带入，计算出各个残糖量。

表2 分批培养下发酵液中的残糖量
Table 2 partial culture conditions of the residual sugar amount fermented liquid
时间/h 0 2 4 6 8 10 12 14
A520
0.5815 0.488 0.416
0.139 0.109 -0.005 -0.004 0.0045
残糖量（g/L）12.9117 10.8246 9.2172 3.0336 2.364 -0.1809 -0.1584 0.0208
2.1.3 生长曲线
表3 分批培养过程中发酵液pH、残糖量及生物量
Table 3 partial the process of cultivation fermented liquid pH, residual sugar quantity and biomass
时间/h 0 2 4 6 8 10 12 14
pH 5.8 5.52 5.26 4.93 4.8 5.03 5.13 5.13 残糖量（g/L）12.9117 10.8246 9.2172 3.0336 2.364 -0.1809 -0.1584 0.0208 生物量（g/L）0 1.33 1.25 1.5 1.5 3 3.25 3.75
图3 分批培养过程中发酵液pH、残糖量及生物量随时间变化曲线
Fig 3 partial the process of cultivation fermented liquid pH, residual sugar quantity and biomass changes wit h time curve
2.2 补料分批培养
2.2.1发酵液pH随时间变化曲线
图4 补料分批培养中发酵液pH随时间变化曲线
Fig 4 fill material in t he cultivation of fermented liquid partial pH change over time curve
2.2.2残糖量的测定
2.2.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制
表4 补料分批培养中葡萄糖标准曲线数据表
Table 4 Fill material partial in the cultivation of glucose standard curve data tables 葡萄糖浓度(mg/mL) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
A520 0.042 0.177 0.334 0.447 0.477 0.661 0.678 0.918
图5补料分批培养的葡萄糖标准曲线
Fig 5 fill material partial training standard curve of glucose
此标准曲线可用来将每2小时取测得520nm下的值转化成发酵液中的残糖量，用于后续分析。

2.2.2.2 残糖量的计算
根据标准曲线的公式计算出残糖量
根据公式y=1.1486x-0.0501,将A520带入，计算出各个残糖量。

表5补料分批培养下发酵液中的残糖量
Table 5 fill material under partial training of t he residual sugar amount fermented liquid
时间/h 0 2 4 6 8 10 12 14
A520 0.629 0.639 0.416 0.139 0.109 -0.003 -0.008 0.004
残糖量（g/L）17.7372 17.9984 12.174 4.9391 4.1555 1.2302 1.0996 0.942
2.2.3 生长曲线
表6 补料分批培养过程中发酵液pH、残糖量及生物量
Table 6 fill material process of cultivation fermented liquid partial pH and residual sugar quantity and biomass
时间/h 0 2 4 6 8 10 12 14
pH 6.3 5.27 5.07 4.81 4.83 4.26 4.4 4.45
残糖量（g/L）17.7372 17.9984 12.174 4.9391 4.1555 1.2302 1.0996 0.942
生物量（g/L） 3 3 1.1 2.2 4.2 3.3 4.5 4
图6补料分批培养过程中发酵液pH、残糖量及生物量随时间变化曲线
Fig 6 fill material process of cultivation fermented liquid partial pH and residual sugar quantity and biomass changes with time
curve
3.结论
分批培养与补料分批培养pH的比较分析：由数据和图表可以看出，分批培养中的pH值是先降后升，由于一开始碳源（即葡萄糖充分）所以经酵母发酵形成有机酸使pH下降，而后期碳源快消耗完了，酵母菌利用氮源产生氨类物质，或菌体自溶产生碱性物质故使pH上升。

而补料分批培养的pH 值是先降，在8h时有些微上升，而后又开始下降，而后又开始上升，但总的趋势是下降然后上升，造成区别的原因是补料分批培养在6h时有补料，所以菌体又开始利用新的碳源。

由于溶氧量没有测，所以在本实验中无法进行比较。

两者的残糖量都是先下降再趋于平稳，并且最后在0坐标附近，变化趋势类似，但在6h时（即补料分批培养的补料点，通过分批培养的图可知，此时残糖量降到低点，且菌体应该生长到了对数期），补料分批培养的残糖量比分批培养的残糖量高，并且发酵过程即将到达终点时，补料分批培养的残糖量也比分批培养的残糖量高。

在生物量方面，分批培养的生物量的趋势线上升、平稳、在上升，最高值为3.75g/L。

而补料分批培养的生物量的趋势线比较杂乱，但也可以看出是在曲折上升，并且生物量最高值为4.5g/L。

通过以上比较可以看出补料分批培养在其他条件雨分批培养都相同时一定程度上能提高酿酒酵母发酵时的生物量。

虽然提高了生物量，但提高的数目比较小。

所以在分批培养与补料分批培养之中，选择补料分批培养比较有利于酿酒酵母的发酵和生长。

同时也可以进一步优化补料分批培养的培养条件，如流加限制性底物而不要一次性添加，控制酵母发酵时的pH值，因为另外pH的降低也会造成酸损伤[5]，调整最适合酿酒酵母发酵的温度，因为温度越低，发酵启动越慢，在同等温度条件下，各菌株表现较为接近[6]。

参考文献：
[1] 张琴. 酿酒酵母采用木糖发酵产乙醇的研究现状[J]. 浙江化工, 2011, 42 (2): 11-15.
[2] 熊子书. 中国酿酒酵母菌的研究[J]. 酿酒科技, 2002, 4: 23-26.
[3] 邢建字, 杨莉. 培养基中各营养组分对酿酒酵母发酵的影响[J]. 食品研究与开发, 2011, 32 (2): 139-142.
[4] 唐军, 黄良军, 蔡水洪. Candida krusei的分批培养与补料分批培养生产甘油[J]. 化学反应工程与工艺, 2011, 17 (1): 50-53.
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[6] 程超, 韩北忠, 陈晶瑜等. 本土葡萄酒酿酒酵母发酵性能的比较[J]. China Brewing, 2008, 17: 8-10.。