酿酒酵母的发酵过程优化

酿酒酵母的发酵过程优化

摘要：分批培养是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量微生物菌种进行培养，使微生物生长繁殖，在特定条件下完成一个生长周期的微生物培养方法。补料分批培养则是在培养过程中间歇或连续的添加新鲜培养基。

本次实验分别通过补料分批培养与分批培养，测定相应的pH值、溶氧量、生物量、残糖量等，并比较分批培养和分批补料培养酵母细胞发酵过程的过程规律，从而达到优化酵母的发酵过程的目的。

关键字：分批培养；补料分批培养；酵母发酵过程

Optimiztion of the yeast fermentation process

Mo Xiaoyu

(Changshu Institute of Technology Jiangsu Province Changshu 215500 )

Abstract：Batch culture is a method to culture microorganism by put limited nutrient substance into closed-system.Then access to culture a few microorganism strains, make microbes grow, let them to complete a growth cycle of microorganism training method in particular conditions. Fed-batch cultivation is a method to culture microorganism by adding fresh medium in the process of cultivation intermittently or continuously.

This experiment was through the batch culture and fed-batch cultivation,determination of the corresponding pH value, oxygen, biomass, residual sugar content, and more partial training and fed-batch culture training yeast cells of the fermentation process rules, so as to optimize the yeast fermentation process.

Keywords：batch culture; fed-batch cultivation; yeast fermentation process

酵母菌为单细胞微生物，属真菌类。从酵母菌分类系统来讲属于真酵母属。酿酒酵母具有安全性好，高产量和高的抑制剂耐受性等优点，故一直在生物乙醇工业中有重要作用[1]。通常以出芽繁殖。繁殖速度较霉菌快，与原生动物不同，有坚韧的细胞壁，菌体比细菌大且形态复杂。繁殖时有的能进行二等份分裂，有的种类能产生于囊孢子。其形态因培养基种类及培养时间的长短而异，分别为圆形、卵形、椭圆形或腊肠形等，内有细胞核、液泡和颗粒物质[2]。

酵母菌在自然界分布甚广，为发酵工业酿酒酵母为兼性厌氧型微生物，利用酵母菌发酵生产工业乙醇具有辽阔的应用前景。发酵培养基是酿酒酵母营养和能量的来源，其组分在发酵过程中无疑起着更为关键的作用[3]。从普通酿酒酵母菌株的营养条件出发进行研究，在其他的条件均相同的情况下，通过分批培养与补料分批培养（补料分批培养在培养至残糖量最低时进行补料）培养相同的普通酵母菌株。由于在分批培养中菌体生长无法控制，容易有副产物形成，因而影响发酵产率。补料培养在有效地利用原料、减少副产物、提高产物生产水平方面均有显著的效果，而且也是生产中比较切实可行的方法[4]。通过发酵培养过程中得到的pH值、溶氧量、生物量、残糖量等数据，进行处理与分析，以期得到优化酿酒酵母发酵过程的方法。

1材料与方法

1.1菌种

实验室自备的酿酒酵母

1.2 培养基

PDA（斜面、平板培养基）：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，水1000ml，自然pH。制法：马铃薯去皮后，切成小块，加水煮烂（煮沸20-30min，能被玻璃棒戳破即可），用4层纱布过滤，再加糖和琼脂，加热溶化后在补足水分至1000 ml，121℃灭菌20min。

种子培养基（YEPD培养基）：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH6.0，121℃湿热灭菌20min。

发酵培养基：YEPD培养基。酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH6.0，121℃湿热灭菌20min。

1.3仪器与设备

发酵罐、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管架、电子天平，烧杯，锥形瓶，量筒，试管，玻璃棒，培养皿，移液管、注射器（取样用）、离心管等。

1.4试剂

3，5-二硝基水杨酸等。

1.5方法

1.5.1 培养基配制、分装和灭菌

1.5.1.1 配制PDA培养基，121℃灭菌20min，倒无菌平板活化菌种。配制YEPD培养基，并进行分装灭菌。

1.5.1.2 10ml培养基分装到50ml三角瓶中（培养一级种子），20ml培养基分装到100ml三角瓶中，（培养二级种子，作为分批培养种子液）。20ml培养基分装到100ml三角瓶中，（培养二级种子，作为补料分批培养种子液）。121℃灭菌20min。

1.5.1.3 发酵罐培养基分装及灭菌

将发酵罐中加入2000ml培养基，盖好盖子，pH电极、溶氧电极等经校正后插入发酵罐中，取样口、进气口用牛皮纸扎好，用夹子把每个直通液面以下的管子夹紧，121℃灭菌20min。

1.5.2 玻璃器皿包装及灭菌

将培养皿、移液管包装好121℃灭菌20min。

1.5.3 种子液的制备

自斜面菌种挑取酵母菌体，接入装有10 ml培养基的50ml三角瓶中，30℃，180r/min培养18h。将上述培养好的种子液分别接入两个装有20ml培养基的100ml三角瓶中，接种量10%，30℃，180r/min培养18h。

1.5.4 接种

将培养好的种子液以10%（v/v）接种量接种到发酵罐培养基中，180r/min，30℃培养48h，调节通气量为3L/min。

1.5.5 实时监测pH和溶氧量

从发酵开始，每隔2h在线读取发酵罐中发酵液pH，及溶解氧量。

1.5.6 补料

在细胞生长的对数生长期中后期一次性添加20g葡萄糖到发酵罐中。

1.5.7 葡萄糖标准曲线的测定

葡萄糖标准曲线的测定用DNS法。

3,5-二硝基水杨酸试剂：

甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2ml10%氢氧化钠溶液中，并用水稀释至69ml，在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。

乙液：称取255g酒石酸钾钠加到300ml10%氢氧化钠溶液中，再加入880ml1%3,5二硝基水杨酸溶液。

将甲乙二溶液混合既得黄色试剂，储于棕色瓶中备用。在室温放置7-10天以后使用。

葡萄糖标准溶液的配制：

准确称取100mg分析纯的无水葡萄糖（预先在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定