骨髓基质干细胞来源的血管内皮细胞
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于东升 , 李琪佳 , 贾
1 1
鹂 , 白俊清 , 王志强
2
2
2
( 华北煤炭医学院 : 摘
1
实验中心 ,
2
附属医院骨科 , 河北 唐山 063000)
G ene expression of angiogenin1 and an giogenin2 of endothelial cells derived from rat bone m arrow m esenchym al ste m cells
[ 1- 4]
收稿日期 : 2009 03 10 ;
接受日期 : 2009 06 24
基金项目 : 河北省教育厅基金 ( 2005105 ) 通讯作者 : 李琪佳 . Te: l ( 0315) 3725747 Em ai:l q jl1222 @ hot m ai. l com 作者简介 : 于 东 升 . 硕 士 生 ( 导 师 李 琪 佳 ). T e:l ( 0315 ) 3725276 Ema i:l yds06107 @ 126. com
Buffer 4 L, dNTP M ix ture 2 L, RN ase Inh ib itor 1 L, L, ReverT ra Ace 1 L, RT 总反 应 体系 为 20 L; 42# 20 m in , 99# L, 灭
5 m in , 4# 5 m in , 瞬间离心, - 20# 保存 . PCR 扩增 : 依次加入逆转录反应产 物 20 菌蒸馏水 67 L, 10 ∀ PCR Buffer 10 L, 目的基因上 下游引物 ( 10 m ol /L )各 1 L, KOD Dash 1 L, 总体 系为 100 L; 反应条件 : 94# 60 s 预变性 , 98# 10 s 变性, 60# 2 s退火, 74# 15 s延伸 , 30 循环 . 取 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳, 凝胶成像系统测定 A 值 , 分别计算各基因与 actin 基因的光密度比值. 基因 特异性引物的序列及目的基因片段大小见表 1 . 统计学处理: 用 SPSS10 . 0统计软件分析, 数据以 . 05 为 x ∃ s 表示 , 两组间差异比较采用 t 检验, P < 0 差异有统计学意义 .
1 材料和方法
1 . 1 材 料 高 糖 DMEM 培 养 基、 M 199 培 养 基 ( G ib co 公司 ) ; 胎牛血清 ( 天津血研所科技公司 ); 血
2066
第四军医大学学报 ( J F ourth M ilM ed U niv) 2009, 30( 20)
http: / /www. f m muxb. cn
异丙醇, 冰上静置 10 m in; 12 000 g 4# 离心 10 m in, 弃上 清, 加 750 mL /L 乙 醇 1 mL; 7500 g 4# 离 心 10 m in, 弃上清, 晾干后溶于 无 RNA 酶水中, - 70# 保存. 1 . 2. 6 逆转录反应 按照 TOYOBO PCR 400 试剂 L, 5 ∀ RT 盒说明进行, 依次加入 RN ase F ree H 2 O 9 O ligo ( dT ) 20 1 L, T otal RNA 2
管内皮细胞生长因子 ( VEGF, R& D 公司 ) ; 碱性成纤 维细胞生长因子 ( bFGF, R& D 公司 ); 山羊抗大 鼠单 克隆抗体 CD31( San ta 公司 ); 兔 抗大鼠多克隆抗 体 CD34(武 汉 博士 德公 司 ); T rizo l试 剂 ( Inv itrig en 公 司 ) ; RT PCR 试剂盒 ( T oyobo 公司 ); 引物 Ang1 , Ang2 ( 北京三博远志科技公司合成 ). 1 . 2 方法 1 . 2 . 1 大鼠 BM SC s的原代及传代培养 4 w k 龄 SD 大鼠 (雌雄不限 ) 脱颈处死后 , 无菌条件下取其 双侧 股骨和胫骨, 显露骨髓腔 . 用含双抗 ( 青链 霉素 ) 的 DM EM 培养基反复冲洗骨髓腔 , 以冲洗出骨髓. 将骨 髓悬液 1000 r/m in 离心 10 m in, 弃上清后加入完全培 养基 , 吹 打 成单 细胞 悬 液, 接 种于 培 养瓶 中, 置 于 50 mL /L CO 2 孵箱中培养 . 待原代 BMSC s长满瓶底 90% 左右时 , 进行传代培养 . 1 . 2 . 2 大鼠血管内皮细胞的诱导培养 加入含有 20 m L /L 胎牛血清、 10 细胞传至第
YU D ong Sheng 1, LI Q i J ia1 , JI A Li2 , BA I Jun Q ing 2 , WAN G Zhi Q iang 2
1
要 ! 目的 : 研究 骨髓基 质干 细胞来 源的 血管内 皮细 胞
表达成熟血管内皮细 胞特异 性基因 , 探 讨为组 织工 程血管 化 提供种子细胞的可 行性 . 方 法 : 从 SD 大鼠 后肢 获取 骨髓 基 质干细胞 , 进行体外扩增培养 , 取生长良好的 第 3 代细胞 体外 诱导培养 14 d . 细 胞分 诱 导 组 ( 含 内 皮 诱 导因 子 V EGF 和 bFG F 的完全血管内皮细胞条件培养基 ) 和对照组 ( 含 M 199 普 通培养基 ). M TT 法 检测两 组细 胞增殖 活性 . 免 疫细 胞化 学 法检测 CD 31, CD 34 蛋 白的表 达 ; RT PCR 检 测细胞 血管生 成 素 1( A ng1) 、 血管生成素 2( ang iogenin2, A ng2) mRNA 的表达 . 结果 : M TT 法检测发现 , 诱导组与对照组在 1, 2, 3, 4, 5 d 5 个 时间点内 , 其细胞增 殖活性无 显著性差异 ( P 1d = 0. 855, P 2d = 0 . 053, P 3d = 0. 249, P 4d = 0. 059, P 5d = 0. 174). 免疫细胞化学 检测结 果 CD34, CD31 呈 阳性 表达 . RT PCR 结果 显示 , 诱 导 的血管内皮细胞 表达 成熟内 皮细 胞特 异性 基因 A ng1, Ang2 . 结论 : 骨髓基质干细胞在一定诱导条件 下可以表 达血管 内皮 细胞特异性标志 , 可作为组织工程血管化理想的种子细胞 . 关键词 ! 骨髓基质干细胞 ; 血管内 皮细胞 ; 诱导 ; 分化 ; PCR 中图号 ! R318 文献标识码 ! A
L aboratory Center , N o rth
Biblioteka Baidu
2
Departm ent of O rthopaedics , Coal M ed ica l Co llege ,
A ffiliated T ang shan
Ho sp ita, l
China
063000 , China Abstract ! AIM: T o investiga te the spec ific genes o f vascu la r endothelial ce lls ( VEC ) fro m bone m a rrow m esenchym al ste m ce lls ( BM SC s ), and po ssib ility to prov id ing seed ce lls fo r vascu la rization o f tissue eng ineering . METHOD S : BM SCs we re iso lated fro m poster io r li m bs o f rat and expanded in vitro . BM SCs o f the th ird generation w ere cultured w ith the cond itional m ed ium for 14 d. T he ce lls w ere d iv ided into induced group( conta ining VEG F , bFG F endothe lia l ce ll m edium ) and contro l g roup ( conta in ing M 199 bas ic m ed ium ). T he pro lifera tion activ ity of ce lls w as tested by M TT. T he CD34 and CD31 prote ins we re exam ined by i m munocytoche m istry sta in ing and the g ene expres sion of ang iogenin1 and ang iogen in2 w ere detected by RT PCR. RE S ULTS : T he re w as no s ignificant d iffe rence in pro life ration activ ity be t w een induced group and contro l g roup ( P 1 d = 0 . 855, P2 d = 0 . 053, P 3 d = 0 . 249, P 4 d = 0. 059 , P 5 d = 0. 174). The induced ce lls we re positive for the m arker CD34 and CD 31 pro te ins , and RT PCR sho w ed gene expression of m ature endo the lial spec ific m arkers ang iog en in1 and ang iogen in2 . CONCLUSION: BM SC s can be differentiated into ce lls w ith cha racte ristics of vascu la r endo the lial ce lls , eng inee ring vascular iza tion . K eywords! bone m arrow mesenchyma l ste m ce lls; vascu la r endo the lial ce lls ; induced ; differentiation; PCR they a re idea l seed cells o f tissue
第四军医大学学报 ( J Fourth M ilM ed U n iv ) 2009, 30( 20)
http: / /www. fmm uxb. cn
2065
研究原著
文章编号 : 1000 2790( 2009) 20 2065 04
骨髓基质干细胞来源的血管内皮细胞 Angi ogenin1, Angiogeni n2 基因的 表达
0 引言
随着组织工程血管化研究的进展 , 种子细胞之一 血管内皮细胞 ( vascular endo th e lia l cells , VEC )在组织 工程血管化的研究中具有重要地位, 如何获取足量的 VEC 是当前重点需要解决的问题 . 目前血管化所用 内皮细胞有直接从器官组织分离而来的成熟 VEC 和 从干细胞 诱导 分化 来的血 管 内皮 细胞 . 由于 成熟 VEC 可供取材的供区来源有限 , 且成熟 VEC 多为终 末分化细胞, 体外培养扩增中细胞易老化, 扩增数量 有限等缺陷. 因此寻找初期分化的血管内皮细胞已 成为组织工程血管化的关键所在 . 本实验我们 拟采用 SD 大鼠骨髓基质干细胞 ( bone m arrow m esen chym a l stem ce lls , BM SC s) 体外定向诱导分化为血管 内皮细胞 , 在基因水平上检测血管生成素 1( Ang ioge n in1 , Ang1) 、 血管生成素 2 ( Ang io genin2 , Ang2) 的表 达 , 从而为组织工程血管化构建提供实验基础.
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鹂 , 白俊清 , 王志强
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( 华北煤炭医学院 : 摘
1
实验中心 ,
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附属医院骨科 , 河北 唐山 063000)
G ene expression of angiogenin1 and an giogenin2 of endothelial cells derived from rat bone m arrow m esenchym al ste m cells
[ 1- 4]
收稿日期 : 2009 03 10 ;
接受日期 : 2009 06 24
基金项目 : 河北省教育厅基金 ( 2005105 ) 通讯作者 : 李琪佳 . Te: l ( 0315) 3725747 Em ai:l q jl1222 @ hot m ai. l com 作者简介 : 于 东 升 . 硕 士 生 ( 导 师 李 琪 佳 ). T e:l ( 0315 ) 3725276 Ema i:l yds06107 @ 126. com
Buffer 4 L, dNTP M ix ture 2 L, RN ase Inh ib itor 1 L, L, ReverT ra Ace 1 L, RT 总反 应 体系 为 20 L; 42# 20 m in , 99# L, 灭
5 m in , 4# 5 m in , 瞬间离心, - 20# 保存 . PCR 扩增 : 依次加入逆转录反应产 物 20 菌蒸馏水 67 L, 10 ∀ PCR Buffer 10 L, 目的基因上 下游引物 ( 10 m ol /L )各 1 L, KOD Dash 1 L, 总体 系为 100 L; 反应条件 : 94# 60 s 预变性 , 98# 10 s 变性, 60# 2 s退火, 74# 15 s延伸 , 30 循环 . 取 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳, 凝胶成像系统测定 A 值 , 分别计算各基因与 actin 基因的光密度比值. 基因 特异性引物的序列及目的基因片段大小见表 1 . 统计学处理: 用 SPSS10 . 0统计软件分析, 数据以 . 05 为 x ∃ s 表示 , 两组间差异比较采用 t 检验, P < 0 差异有统计学意义 .
1 材料和方法
1 . 1 材 料 高 糖 DMEM 培 养 基、 M 199 培 养 基 ( G ib co 公司 ) ; 胎牛血清 ( 天津血研所科技公司 ); 血
2066
第四军医大学学报 ( J F ourth M ilM ed U niv) 2009, 30( 20)
http: / /www. f m muxb. cn
异丙醇, 冰上静置 10 m in; 12 000 g 4# 离心 10 m in, 弃上 清, 加 750 mL /L 乙 醇 1 mL; 7500 g 4# 离 心 10 m in, 弃上清, 晾干后溶于 无 RNA 酶水中, - 70# 保存. 1 . 2. 6 逆转录反应 按照 TOYOBO PCR 400 试剂 L, 5 ∀ RT 盒说明进行, 依次加入 RN ase F ree H 2 O 9 O ligo ( dT ) 20 1 L, T otal RNA 2
管内皮细胞生长因子 ( VEGF, R& D 公司 ) ; 碱性成纤 维细胞生长因子 ( bFGF, R& D 公司 ); 山羊抗大 鼠单 克隆抗体 CD31( San ta 公司 ); 兔 抗大鼠多克隆抗 体 CD34(武 汉 博士 德公 司 ); T rizo l试 剂 ( Inv itrig en 公 司 ) ; RT PCR 试剂盒 ( T oyobo 公司 ); 引物 Ang1 , Ang2 ( 北京三博远志科技公司合成 ). 1 . 2 方法 1 . 2 . 1 大鼠 BM SC s的原代及传代培养 4 w k 龄 SD 大鼠 (雌雄不限 ) 脱颈处死后 , 无菌条件下取其 双侧 股骨和胫骨, 显露骨髓腔 . 用含双抗 ( 青链 霉素 ) 的 DM EM 培养基反复冲洗骨髓腔 , 以冲洗出骨髓. 将骨 髓悬液 1000 r/m in 离心 10 m in, 弃上清后加入完全培 养基 , 吹 打 成单 细胞 悬 液, 接 种于 培 养瓶 中, 置 于 50 mL /L CO 2 孵箱中培养 . 待原代 BMSC s长满瓶底 90% 左右时 , 进行传代培养 . 1 . 2 . 2 大鼠血管内皮细胞的诱导培养 加入含有 20 m L /L 胎牛血清、 10 细胞传至第
YU D ong Sheng 1, LI Q i J ia1 , JI A Li2 , BA I Jun Q ing 2 , WAN G Zhi Q iang 2
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要 ! 目的 : 研究 骨髓基 质干 细胞来 源的 血管内 皮细 胞
表达成熟血管内皮细 胞特异 性基因 , 探 讨为组 织工 程血管 化 提供种子细胞的可 行性 . 方 法 : 从 SD 大鼠 后肢 获取 骨髓 基 质干细胞 , 进行体外扩增培养 , 取生长良好的 第 3 代细胞 体外 诱导培养 14 d . 细 胞分 诱 导 组 ( 含 内 皮 诱 导因 子 V EGF 和 bFG F 的完全血管内皮细胞条件培养基 ) 和对照组 ( 含 M 199 普 通培养基 ). M TT 法 检测两 组细 胞增殖 活性 . 免 疫细 胞化 学 法检测 CD 31, CD 34 蛋 白的表 达 ; RT PCR 检 测细胞 血管生 成 素 1( A ng1) 、 血管生成素 2( ang iogenin2, A ng2) mRNA 的表达 . 结果 : M TT 法检测发现 , 诱导组与对照组在 1, 2, 3, 4, 5 d 5 个 时间点内 , 其细胞增 殖活性无 显著性差异 ( P 1d = 0. 855, P 2d = 0 . 053, P 3d = 0. 249, P 4d = 0. 059, P 5d = 0. 174). 免疫细胞化学 检测结 果 CD34, CD31 呈 阳性 表达 . RT PCR 结果 显示 , 诱 导 的血管内皮细胞 表达 成熟内 皮细 胞特 异性 基因 A ng1, Ang2 . 结论 : 骨髓基质干细胞在一定诱导条件 下可以表 达血管 内皮 细胞特异性标志 , 可作为组织工程血管化理想的种子细胞 . 关键词 ! 骨髓基质干细胞 ; 血管内 皮细胞 ; 诱导 ; 分化 ; PCR 中图号 ! R318 文献标识码 ! A
L aboratory Center , N o rth
Biblioteka Baidu
2
Departm ent of O rthopaedics , Coal M ed ica l Co llege ,
A ffiliated T ang shan
Ho sp ita, l
China
063000 , China Abstract ! AIM: T o investiga te the spec ific genes o f vascu la r endothelial ce lls ( VEC ) fro m bone m a rrow m esenchym al ste m ce lls ( BM SC s ), and po ssib ility to prov id ing seed ce lls fo r vascu la rization o f tissue eng ineering . METHOD S : BM SCs we re iso lated fro m poster io r li m bs o f rat and expanded in vitro . BM SCs o f the th ird generation w ere cultured w ith the cond itional m ed ium for 14 d. T he ce lls w ere d iv ided into induced group( conta ining VEG F , bFG F endothe lia l ce ll m edium ) and contro l g roup ( conta in ing M 199 bas ic m ed ium ). T he pro lifera tion activ ity of ce lls w as tested by M TT. T he CD34 and CD31 prote ins we re exam ined by i m munocytoche m istry sta in ing and the g ene expres sion of ang iogenin1 and ang iogen in2 w ere detected by RT PCR. RE S ULTS : T he re w as no s ignificant d iffe rence in pro life ration activ ity be t w een induced group and contro l g roup ( P 1 d = 0 . 855, P2 d = 0 . 053, P 3 d = 0 . 249, P 4 d = 0. 059 , P 5 d = 0. 174). The induced ce lls we re positive for the m arker CD34 and CD 31 pro te ins , and RT PCR sho w ed gene expression of m ature endo the lial spec ific m arkers ang iog en in1 and ang iogen in2 . CONCLUSION: BM SC s can be differentiated into ce lls w ith cha racte ristics of vascu la r endo the lial ce lls , eng inee ring vascular iza tion . K eywords! bone m arrow mesenchyma l ste m ce lls; vascu la r endo the lial ce lls ; induced ; differentiation; PCR they a re idea l seed cells o f tissue
第四军医大学学报 ( J Fourth M ilM ed U n iv ) 2009, 30( 20)
http: / /www. fmm uxb. cn
2065
研究原著
文章编号 : 1000 2790( 2009) 20 2065 04
骨髓基质干细胞来源的血管内皮细胞 Angi ogenin1, Angiogeni n2 基因的 表达
0 引言
随着组织工程血管化研究的进展 , 种子细胞之一 血管内皮细胞 ( vascular endo th e lia l cells , VEC )在组织 工程血管化的研究中具有重要地位, 如何获取足量的 VEC 是当前重点需要解决的问题 . 目前血管化所用 内皮细胞有直接从器官组织分离而来的成熟 VEC 和 从干细胞 诱导 分化 来的血 管 内皮 细胞 . 由于 成熟 VEC 可供取材的供区来源有限 , 且成熟 VEC 多为终 末分化细胞, 体外培养扩增中细胞易老化, 扩增数量 有限等缺陷. 因此寻找初期分化的血管内皮细胞已 成为组织工程血管化的关键所在 . 本实验我们 拟采用 SD 大鼠骨髓基质干细胞 ( bone m arrow m esen chym a l stem ce lls , BM SC s) 体外定向诱导分化为血管 内皮细胞 , 在基因水平上检测血管生成素 1( Ang ioge n in1 , Ang1) 、 血管生成素 2 ( Ang io genin2 , Ang2) 的表 达 , 从而为组织工程血管化构建提供实验基础.