月季黑斑病病原菌鉴定及生物学特性研究

月季黑斑病病原菌鉴定及生物学特性研究作者：***

来源：《种子科技》2022年第17期

摘要：为科学防治月季在公园等环境下出现的黑斑病，以青岛市海泊河公园的月季植株为例，采集患有黑斑病的植株叶片作为试验原材料，通过单孢分离法实现月季叶片与黑斑病病原体分离，运用形态学鉴定法与人工接种法对病原体进行形态学鉴定和致病性测定，并对其EF1-α、rDNA ITS以及GPD等基因序列进行扩增与测序。由鉴定结果可知，月季黑斑病病原孢子形态为棕褐色棒状，且孢子表面具有横纵方向的隔膜；由多基因系统进化结果证明，导致该月季出现黑斑病的病原为链格孢。经生物学研究结果可知，28 ℃、pH值为6.0且全天光照的条件为病原菌丝的最适生长环境。

关键词：月季；黑斑病；生物学特性

文章编号：1005-2690（2022）17-0028-04 中国图书分类号：S436.8 文献标志码：B

从已掌握的月季病虫害种类的危害性角度来看，黑斑病对月季健康情况影响最严重，并且发病率很高，在我国多地月季种植区域均有出现[1-2]。2021年在青岛市海泊河公园的月季绿化带中发现多株月季患有黑斑病。为此，文章以該地区的患病月季植株为试验对象，以分离纯化的方式从形态与分子方面对黑斑病病原菌种类与生物学特性进行鉴定分析，以期为相关防控单位或科研人员提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

患病植株选取。以青岛市海泊河公园月季绿化带下患黑斑病月季植株（整株）为研究材料，在试验内截取患病叶片作为分离与对照材料。

试剂和培养基。测定试剂采用赛默飞公司的DL DNA Marker、博奥龙 2×Taq PCR Mixture （含上样染料）、Loading buffer，引物见表1所示。

试验使用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，配制方法如下。选取干净且水煮后的马铃薯200 g（滤液）、葡萄糖与琼脂各20 g，将琼脂与马铃薯滤液充分搅拌，待琼脂完全容积后向其中加入称取好的葡萄糖，将冷却后的蒸馏水（1 L）加入其中并将培养液的pH值调节为

7.0，最后将培育液包好放于灭菌锅中灭菌，灭菌完成后取出冷却备用。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离

月季叶片与黑斑病菌丝采用单孢分离法分离。首先，挑选整株月季患病植株中具有明显黑斑病的患病叶片送至实验室，在黑斑病斑点与叶片的交界处选取9 mm×9 mm的组织块，将其浸泡在浓度为75％的乙醇溶液中消毒，浸泡30 s后取出，用无菌水漂洗，共漂洗3次。其

次，将其浸泡在浓度为2％的次氯酸钠溶液中，浸泡时间为60 s，浸泡完成后再次用无菌水浸洗，共浸洗3次。再次，将其放置在灭菌滤纸上转移至无菌室晾干，晾干后将其移放至环境温度为28 ℃恒温环境下的PDA培养基上进行培养。采用第三次清洗液制作涂布平板并将其作为阴性对照，培养4～5 d后观察黑斑病菌菌落生长状况，取菌丝尖端孢子放置于新的PDA培养基中进行培养（培养环境为28 ℃），不断重复上述操作直到分离出纯化菌株。

1.2.2 黑斑病病原菌的形态学鉴定

初步观察纯化菌株培养基下的菌落疏密程度和颜色等菌落特征，将其放置在光学显微镜下进行镜检，重点观察对黑斑病病原菌菌丝和分生孢子的特征，例如分生孢子的形状、大小、残缺程度、孢子梗以及孢子有无隔膜等信息。

1.2.3 黑斑病病原菌的分子生物学鉴定

使用CTAB法对月季黑斑病病原菌的DNA进行提取，实际操作步骤如下。首先，需要在试验开始前将2-丙醇（C3H8O）放置在-20 ℃环境下预冷，将浓度为70％的乙醇放置在4 ℃环境下进行恒温处理，将试验使用的水浴锅加热至57 ℃。用无菌枪头刮取0.1 mL的纯化黑斑病菌丝，并将其置于2 mL的离心管中，将石英砂（20μL）和2％的CTAB提取缓冲液（300

μL）加入装有黑斑病菌丝的离心管中，使用研磨棒对其进行研磨直到所有物体研磨充分为止。向离心管中在此加入2％的CTAB提取缓冲液（200 μL）并充分震荡，将其放置在57 ℃的水浴锅中恒温加热1 h后使其自然冷却至室温，期间要注意每隔10 min对离心管进行1次颠倒混匀。其次，当水浴操作结束之后，需将等体积的500 μL三氯甲烷（CHCl3）和C3H8O （比例为24∶1）溶液加入离心管中，将其放置在离心机中以10 000 r/min的速度离心10 min，在离心操作期间需要将浓度为10％的CTAB提取缓冲液放置在65 ℃环境的水浴中加热。取离心后上清液（300 μL）放置在新的离心管中，并将已加热完成浓度为10％的CTAB 提取缓冲液（30 μL）加入新离心管中，振荡混匀，之后再向其中加入比例为24∶1的CHCl3与C3H8O的混合液（330 mL）。再次，将新的离心管放置在10 000 r/min离心机中离心10 min。取离心后溶液的上清液（250 μL）放置在新的离心管，并向其中加入预冷好的C3H8O （250 μL）轻轻混匀，将其放置在-20 ℃环境下静置30～60 min，将静置完成的溶液再次放置在参数为12 000 r/min、温度为4 ℃的离心机中离心10 min。最后，将离心完毕的溶液上清液缓慢剔除并倒置片刻，向离心管中加入提前预冷浓度为70％的乙醇洗涤（1 mL），放置在10 000 r/min的离心机中震荡离心5 min。离心完成后除去上清液取剩余液体将其放置在工作台上自然风干。制作PCR反应体系（50 μL），其中主要成分包括3 μL模板、1 μL上游引物、1 μL 下游引物，25 μL博奥龙2×Taq PCR Mixture（含上样染料）以及20 μL去离子水。

PCR反应程序参数设定：预变性环境温度为94 ℃、时间为3 min；变性温度为94 ℃、时间为30 s；退火温度为55 ℃、时间为45 s，35个循环；延伸温度为72 ℃、时间为10 min。将扩增产物送至某生物工程研究所进行比对测序，使用BLAST将得到的序列与DNA序列数据库GenBank上对其同源性进行比对，并将与月季黑斑病病原菌有关的同源序列下载到本地，