呼吸道合胞病毒和腺病毒的检测与分型

呼吸道合胞病毒和腺病毒检测与分型
首都儿科研究所 邓洁
大家好！下面我跟大家交流一下呼吸道合胞病毒和腺病毒的检测与分型方法。

呼吸道合胞病毒是属于副粘液病毒科的一种RNA病毒。

它是造成世界范围内婴幼儿下呼吸道病毒性感染最常见的原因之一，特别是2 — 6个月的小婴儿在感染呼吸道合胞病毒以后常常可以发生严重的毛细支气管炎和肺炎。

另外呢它还是引起老年人慢性支气管炎加重以及免疫损伤患儿下呼吸道感染的重要病原。

呼吸道合胞病毒最早是在1956年在伴有感冒症状的猩猩体内分离到的。

在1957年又从患有下呼吸道疾病婴儿的鼻咽分泌物中分离到，由于它在细胞中可以引起细胞融合病变，所以呢就根据它在组织培养中的细胞病变特征呢命名为呼吸道合胞病毒。

呼吸道合胞病毒呢它是由包裹负链RNA的核衣壳和包膜组成，其RNA全长为15225个核苷酸，编码10个蛋白。

其中呢G蛋白和F蛋白呢是位于病毒颗粒的表面，是呼吸道合胞病毒的主要糖蛋白。

呼吸道合胞病毒的抗原变异，在70年代应用动物高价免疫血清的交叉中和试验即证明呼吸道合胞病毒毒株之间存在着细微的差异。

在80年代随着特异的呼吸道合胞病毒单克隆抗体的应用，发现呢在G蛋白、F 蛋白、P蛋白以及N蛋白等蛋白上存在着抗原的变异性。

呼吸道合胞病毒亚型有什么差异呢？我们说呼吸道合胞病毒分为两个亚型A和B，它们的主要区别呢，主要是在于G、F、N、P蛋白上的抗原组成不同，其中G蛋白的可变性最高。

A和B亚型G蛋白之间仅存在5%的抗原相关性，而F蛋白则接近50%。

在氨基酸水平上，A和B亚型G蛋白只有53%的同源性，而F蛋白则为89%。

那么呼吸道合胞病毒亚型与反复感染有什么关系呢？我们说由于G蛋白是激发机体产生保护性抗体最主要的病毒抗原之一，而不同亚型呼吸道合胞病毒G蛋白激发机体产生的保护性抗体呢，不能有效地提供亚型间的交叉保护作用。

所以亚型的存在呢可能是同呼吸道合胞病毒的反复感染有关。

那么呼吸道合胞病毒A、B亚型的致病性又有哪些区别呢？这都是一些文献的报道，有一些文献报道呢，说A亚型呼吸道合胞病毒呢具有较强的致病性。

另外呢还有的人报道是B亚型合胞病毒，无论是在病毒的滴度、形成细胞融合病变的大小和培养时间上，均明显的较A亚型差。

也就是说和上面的那个报道是一致的。

另外呢还有人报道是婴幼儿合胞病毒感染以后呢同，对同型G蛋白的抗原反应呢B亚型较A亚型更加强烈和有效。

那么我们进行呼吸道合胞病毒亚型监测有什么意义呢？我们说呢呼吸道合胞病毒和疾病的严重程度之间的关系目前呢还没有定论，而且呢亚型的存在可能与呼吸道合胞病毒的反复感染有关。

因此我们认为监测人群中呼吸道合胞病毒的流行以何种亚型为主呢，对流行病学研究及疫苗的发展都是有极其重要的意义的。

我国呼吸道合胞病毒感染与流行情况是什么的呢？呼吸道合胞病毒的感染呢具有明显的季节性，在我国南方流行高峰呢主要是在夏秋季，在北方呢则主要发生在冬春季。

沈皆平教授以及王之梁教授都曾有过这方面的报道。

呼吸道合胞病毒与流喘肺炎呢，又有什么关系呢？在我国每隔数年就会出现一次由呼吸道合胞病毒感
染导致的流行性喘憋型肺炎，简称流传肺炎的爆发流行。

这种病呢往往会造成数十万人发病，数万人住院，并造成死亡。

首都儿科研究所的林良明教授、刘成贵教授、邓洁主任技师等，在这方面呢都做过报道。

流喘肺炎的爆发流行，流喘肺炎呢曾于1971年、1972年、1975年在浙江、上海、江西、福建、广东和广西六省市流行，据不完全统计，三个年份的总发病数都在10万以上。

那么还在1986年初在山西运城地区，1989年冬在北京郊县，1991年冬在河北农村及天津郊县，1999年冬在河南省汝阳县都曾有过爆发流行。

并且呢它们的病原检测结果均是呼吸道合胞病毒A亚型。

近年呼吸道合胞病毒的监测。

我们呢曾对2000年到2006年的呼吸道合胞病毒进行了监测，监测结果发现呢，呼吸道合胞病毒呢呈现出隔年流行高峰的流行趋势。

而且不同年份的A、B亚型呢可以交替成为流行优势株。

A亚型大约为B亚型的2.4倍，于美国和瑞典报道的结果相似。

我们呢在这，我们曾将这一结果呢在中国儿科杂志上以论著的形式进行了报道和发表。

近年呼吸道合胞病毒的监测。

据文献报道呢近年流行的B亚型呼吸道合胞病毒G蛋白出现了新的基因特征。

我们呢也对近年北京地区流行的B亚型呼吸道合胞病毒G蛋白进行了基因分析。

也发现了在C末端的高变区的791位后出现了有60个核苷酸插入的变异株。

这是我们在2000年，对2000年和2004年分离的呼吸道合胞病毒B亚型基因的序列分析中呢发现了这一变异株，并将这一结果呢在《中华微生物学》和《免疫学》杂志上发表。

呼吸道合胞病毒的分型检测方法都有哪些呢？最早呼吸道合胞病毒呢被认为是只有一个单一的血清，但其抗原变异呢早在60年代就有报道。

在80年代，随着单克隆抗体的应用，有学者根据合胞病毒分离株同单克隆抗体的反应性将呼吸道合胞病毒分为A和B两个主要的抗原亚型。

RT-PCR分型检测方法。

随着cDNA克隆技术的发展与应用，呼吸道合胞病毒的核苷酸序列和氨基酸序列也研究的越来越清楚，呼吸道合胞病毒亚型之间以及同一呼吸道合胞病毒亚型内的抗原差异性从基因水平上也得到了证实。

那么利用呼吸道合胞病毒G蛋白基因序列在不同亚型间具有高度变异性，而同亚间相对保守的特性，我们可以建立PCR的检测方法，能够快速特异的来检测临床标本中的呼吸道合胞病毒，同时呢又能对呼吸道合胞病毒阳性标本呢来进行分型。

RT-PCR。

1998年朱汝南等参考国外文献，利用呼吸道合胞病毒G蛋白基因在不同的亚间高度变异这一特点，设计并建立了用逆转录-聚合酶链反应来鉴别呼吸道合胞病毒亚型的方法。

他这一篇文章呢发表在《中华儿科》杂志1998年36卷第9期。

这就是他这篇文章的主要内容，他主要是参考呼吸道合胞病毒A和B亚型原型株Long株和CH18537株的G 蛋白编码基因的核苷酸序列，设计3个引物，P1、P2和P3。

P1呢是根据G蛋白基因5 ' 端核苷酸的序列设计，由于此处呢A、B亚型间高度保守，因此呢为A、B亚型的通用引物。

P2和P3呢分别位于核苷酸的3 '端，它分别与A亚型和B亚型互补，这样呢与P1呢可以共同扩增出277个bp的A亚型片断，或者是与P1呢扩增出B亚型的863个bp的片断。

PCR扩等产物在琼脂糖凝胶中进行电泳，然后根据条带的大小，就可以判定A、B亚型。

巢式PCR检测方法，就是先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量，然后呢再用一对内引物扩增以得到特异的PCR产物，这种方法就是巢式PCR的检测方法。

首都儿科研究所的赵林清呢曾经进行过呼吸道合胞病毒检测方法的比较，他就尝试过用呼吸道合胞病毒A、B亚型原型株Lang株和18537G蛋白编码基因的核苷酸序列设计了巢式PCR引物，一共是6个引物，前3个引物呢为一次PCR引物，后3个引物为二次PCR引物。

最后呢是通过扩增呢，如果是A亚型毒株呢可以扩增
出250个bp的片断，如果是B亚型毒株呢可以扩增出341个bp的片断。

Real-Time PCR，也就是实时荧光定量PCR技术。

这种技术呢是在20世纪90年代中后期发展起来的一项全新的技术，就是实时监测PCR扩增产物并进行解析的方法。

它是在PCR反应体系中呢加入了荧光物质，并通过检测系统中对PCR反应进程中的荧光信号强度来进行实时监测，最终呢对实验数据进行分析处理。

作为一种体外基因的扩增技术，它将PCR反应的灵敏性和探针杂交的特异性合二为一，不但减少了循环时间，省去了传统的电泳、照相等操作步骤，也同时减少了操作过程中发生污染的机会。

首都儿科研究所的孙宇呢曾经做过这方面的工作，他也是利用呼吸道合胞病毒A、B亚型间的区别呢，来分别设计合成了A亚型和B亚型的引物和探针，分两管呢同时进行合胞病毒A亚型和B亚型的扩增。

以上呢就是我们进行了一些呼吸道合胞病毒的检测方法和分型方法的减少，下面呢我们来说一下腺病毒的检测方法和分型。

腺病毒呢它是球形，无包膜的结构。

在电镜下呢看它呈典型的二十面立体对成结构。

而且呢血清型的基因组大小呢有所不同。

腺病毒毒粒呢一共有252个壳粒组成衣壳。

其中包括240个六邻体，12个五邻体。

腺病毒的主要免疫蛋白呢就是六邻体和五邻体。

六邻体分子呢有一个五面体的基底和三角形的塔尖，基底呢包含有两个区域，P1和P2区，塔区呢则由4个环来构成。

六邻体表面的许多抗原决定簇呢都存在这几个环上。

而基底区的P1和P2区呢则是相对保守的区域，变化区呢主要是集中在第一个环和第二个环上。

腺病毒的型别比较多，目前呢已经将腺病毒呢分为为52个血清型，7个亚组。

这是2009年8月按照国际分类委员会的分类标准来进行的分类，其中有7个亚组、52个血清型。

腺病毒可以引起多种临床疾病，比如感冒、喉炎、支气管炎和肺炎等，并多发于5岁以内的婴幼儿。

另外呢腺病毒还可以引起咽结膜炎、腹泻、急性胃肠炎、肠套叠和急性出血性膀胱炎等。

人类腺病毒各亚属与人类疾病有一定的相关性。

比如说B组、C组和E组呢常常可以引起呼吸道疾病，A 组呢可以引起肠道感染，B组可以引起角膜结合膜炎，而F组呢可以引起婴幼儿腹泻。

腺病毒呢在我国历史上发生过多次的爆发流行。

在1958天以来我国各地相继证实，腺病毒除引起上呼吸道感染以外呢，还可以引起小儿肺炎，多见于6个月至2岁以内的婴幼儿，其中华北、东北以及西北于1958年冬及1963年冬都有过较大规模的腺病毒肺炎流行。

当时住院病人的病死率高达25%，病情极其严重。

近年来呢，全国各地虽然没有这种大规模的爆发流行，但是局部小的流行也是时有报道。

这是1958年发生的那次腺病毒的大流行，我们看在我国北方的大部分地区都有爆发。

这是近年的一些报道。

在204年江苏省东台市报道有3型腺病毒感染，2004 — 2005年台湾地区也报道有3型腺病毒感染。

2005 — 2006年呢加拿大报道有7型腺病毒感染。

在2006年呢中国CDC曾报道呢，山西省发生过11型腺病毒感染的爆发流行。

但后来进一步的研究发现呢，这是11型和14型重组的变异株，后来把它命名为腺病毒55型。

在2004 — 2006年呢我们首都儿科研究所，也对腺病毒感染进行了研究，我们发现呢在北京地区呢主要以3型和7型为主，3型腺病毒多于7型，11型呢也有一些，但比较少。

美国在2007年3月到6月呢在3个洲报道有140例病人感染了腺病毒14型，并且导致9人死亡。

腺病毒的型别众多，我们如何来进行腺病毒的鉴定和分型呢？首先我们来说经典腺病毒的鉴定和分型
方法。

由于腺病毒存在着补体结合群特异性抗原，所以当细胞培养管如果出现疑似腺病毒病变以后呢，一般采用下述方法来进行鉴定。

首先用补体结合试验来鉴定是否属于腺病毒组，然后用血凝试验或混合血清做中和试验来缩小腺病毒型别的鉴定范围，最后用型特异性免疫血清做中和试验或血凝抑制试验定型。

腺病毒血凝性分组。

这是利用腺病毒对于不同的红血球有不同的凝集性来进行简单的分组。

有的只凝集恒河猴红血球，有的完全凝集大白鼠红血球，还有的部分凝集大白鼠红血球，还有只稍微凝集大白鼠红血球，利用这一特性呢我们可以进行一些简单的分组。

下面我们来介绍分子生物学技术来进行腺病毒的检测和分型。

这些呢主要包括PCR技术、Real-time PCR技术、PCR-酶切技术、PCR-序列测定技术，以及PCR-基因芯片技术。

PCR-酶切，这是出现于20世纪80年代早期，最早是代替免疫学分型的一种技术。

它呢首先是先进行PCR扩增，然后将产物进行酶切，最后来进行电泳。

它的优点呢是简单和实用，不需要制备和标记众多的探针。

缺点呢就是如果酶切位点出现突变，就会分型失败。

这是腺病毒酶切的一个应用实例。

这是日本的一个学者，他呢是利用3个限制性内切酶来进行消化，然后通过不同的条带来区分不同的血清型。

另外还有多重PCR的检测方法，就是在同一个PCR反应体系里呢加上两对以上的引物，这种方法呢它具有高效性和经济简便性。

这是多重PCR的应用实例。

在2001年没有学者发表的一篇文章，他们是将腺病毒3、7、21型三对引物呢放到一管里，通过一次PCR扩增来进行区分。

参照国外文献，我们呢也进行了巢式多重聚合酶链反应引物的设计，我们呢第一次引物是针对3、7、11、21型为通用的一个，通用引物，扩增产物呢为1278bp的片断。

二次引物呢为3、7、11、21型的特异性引物，扩增产物分别为502、311、880和237个bp，然后通过扩增条带大小不同呢来进行不同型别腺病毒的区分。

荧光定量PCR应用实例。

荷兰学者在2008年发表的一篇文章，他们呢合成了腺病毒的一对通用引物，不论是A组一直到F组，只要是腺病毒呢通过这次PCR扩增呢就可以进行检测。

另外呢美国学者也发明了2管PCR扩增来进行腺病毒检测的一个试验，他们呢第一关呢是可以扩增出A组、F组和9D组，第二管呢可以扩增出B组、C组、D组和E组腺病毒。

英国学者还尝试了通过Real-time的方法呢进行巨细胞病毒、EB病毒以及腺病毒的检测与鉴定。

PCR-序列测定技术。

我们说呢DNA序列测定是最直接、最准确的基因诊断技术。

这是我们通过PCR序列测定来进行腺病毒检测的一项工作。

这篇文章呢我们发表在《中华儿科》杂志2010年48卷第10期。

我们主要就是设计两套巢式PCR引物，一个为通用引物，一个为3、7、11、21型特异性引物。

我们将一份标本用通用引物和特异性引物同时进行扩增，当通用引物扩增为阳性，而特异性引物扩增为阴性时呢，我们就将这个通用引物扩增的产物进行测序，然后与基因GneBank上的序列比较，确定其型别。

展望。

随着计算机技术的不断发展，临床病原检测将向着高度自动化和开发简便的快速检测技术两个方向发展。

那么随着多学科交叉时代的到来，最终将彻底改变临床病原菌检测的现状和传统观念，实现高效高质快速统一。

那么具体应该应用什么样的检测方法，我们一定要针对各实验室的具体情况来进行选择。

这就是我进行的一些合胞病毒和腺病毒检测方法及分型方法的介绍，谢谢大家！。