呼吸道合胞病毒和腺病毒的检测与分型

呼吸道合胞病毒和腺病毒检测与分型

首都儿科研究所 邓洁

大家好！下面我跟大家交流一下呼吸道合胞病毒和腺病毒的检测与分型方法。

呼吸道合胞病毒是属于副粘液病毒科的一种RNA病毒。它是造成世界范围内婴幼儿下呼吸道病毒性感染最常见的原因之一，特别是2 — 6个月的小婴儿在感染呼吸道合胞病毒以后常常可以发生严重的毛细支气管炎和肺炎。另外呢它还是引起老年人慢性支气管炎加重以及免疫损伤患儿下呼吸道感染的重要病原。

呼吸道合胞病毒最早是在1956年在伴有感冒症状的猩猩体内分离到的。在1957年又从患有下呼吸道疾病婴儿的鼻咽分泌物中分离到，由于它在细胞中可以引起细胞融合病变，所以呢就根据它在组织培养中的细胞病变特征呢命名为呼吸道合胞病毒。

呼吸道合胞病毒呢它是由包裹负链RNA的核衣壳和包膜组成，其RNA全长为15225个核苷酸，编码10个蛋白。其中呢G蛋白和F蛋白呢是位于病毒颗粒的表面，是呼吸道合胞病毒的主要糖蛋白。

呼吸道合胞病毒的抗原变异，在70年代应用动物高价免疫血清的交叉中和试验即证明呼吸道合胞病毒毒株之间存在着细微的差异。在80年代随着特异的呼吸道合胞病毒单克隆抗体的应用，发现呢在G蛋白、F 蛋白、P蛋白以及N蛋白等蛋白上存在着抗原的变异性。

呼吸道合胞病毒亚型有什么差异呢？我们说呼吸道合胞病毒分为两个亚型A和B，它们的主要区别呢，主要是在于G、F、N、P蛋白上的抗原组成不同，其中G蛋白的可变性最高。A和B亚型G蛋白之间仅存在5%的抗原相关性，而F蛋白则接近50%。在氨基酸水平上，A和B亚型G蛋白只有53%的同源性，而F蛋白则为89%。

那么呼吸道合胞病毒亚型与反复感染有什么关系呢？我们说由于G蛋白是激发机体产生保护性抗体最主要的病毒抗原之一，而不同亚型呼吸道合胞病毒G蛋白激发机体产生的保护性抗体呢，不能有效地提供亚型间的交叉保护作用。所以亚型的存在呢可能是同呼吸道合胞病毒的反复感染有关。

那么呼吸道合胞病毒A、B亚型的致病性又有哪些区别呢？这都是一些文献的报道，有一些文献报道呢，说A亚型呼吸道合胞病毒呢具有较强的致病性。另外呢还有的人报道是B亚型合胞病毒，无论是在病毒的滴度、形成细胞融合病变的大小和培养时间上，均明显的较A亚型差。也就是说和上面的那个报道是一致的。另外呢还有人报道是婴幼儿合胞病毒感染以后呢同，对同型G蛋白的抗原反应呢B亚型较A亚型更加强烈和有效。

那么我们进行呼吸道合胞病毒亚型监测有什么意义呢？我们说呢呼吸道合胞病毒和疾病的严重程度之间的关系目前呢还没有定论，而且呢亚型的存在可能与呼吸道合胞病毒的反复感染有关。因此我们认为监测人群中呼吸道合胞病毒的流行以何种亚型为主呢，对流行病学研究及疫苗的发展都是有极其重要的意义的。

我国呼吸道合胞病毒感染与流行情况是什么的呢？呼吸道合胞病毒的感染呢具有明显的季节性，在我国南方流行高峰呢主要是在夏秋季，在北方呢则主要发生在冬春季。沈皆平教授以及王之梁教授都曾有过这方面的报道。

呼吸道合胞病毒与流喘肺炎呢，又有什么关系呢？在我国每隔数年就会出现一次由呼吸道合胞病毒感

染导致的流行性喘憋型肺炎，简称流传肺炎的爆发流行。这种病呢往往会造成数十万人发病，数万人住院，并造成死亡。首都儿科研究所的林良明教授、刘成贵教授、邓洁主任技师等，在这方面呢都做过报道。

流喘肺炎的爆发流行，流喘肺炎呢曾于1971年、1972年、1975年在浙江、上海、江西、福建、广东和广西六省市流行，据不完全统计，三个年份的总发病数都在10万以上。那么还在1986年初在山西运城地区，1989年冬在北京郊县，1991年冬在河北农村及天津郊县，1999年冬在河南省汝阳县都曾有过爆发流行。并且呢它们的病原检测结果均是呼吸道合胞病毒A亚型。

近年呼吸道合胞病毒的监测。我们呢曾对2000年到2006年的呼吸道合胞病毒进行了监测，监测结果发现呢，呼吸道合胞病毒呢呈现出隔年流行高峰的流行趋势。而且不同年份的A、B亚型呢可以交替成为流行优势株。A亚型大约为B亚型的2.4倍，于美国和瑞典报道的结果相似。我们呢在这，我们曾将这一结果呢在中国儿科杂志上以论著的形式进行了报道和发表。

近年呼吸道合胞病毒的监测。据文献报道呢近年流行的B亚型呼吸道合胞病毒G蛋白出现了新的基因特征。我们呢也对近年北京地区流行的B亚型呼吸道合胞病毒G蛋白进行了基因分析。也发现了在C末端的高变区的791位后出现了有60个核苷酸插入的变异株。这是我们在2000年，对2000年和2004年分离的呼吸道合胞病毒B亚型基因的序列分析中呢发现了这一变异株，并将这一结果呢在《中华微生物学》和《免疫学》杂志上发表。

呼吸道合胞病毒的分型检测方法都有哪些呢？最早呼吸道合胞病毒呢被认为是只有一个单一的血清，但其抗原变异呢早在60年代就有报道。在80年代，随着单克隆抗体的应用，有学者根据合胞病毒分离株同单克隆抗体的反应性将呼吸道合胞病毒分为A和B两个主要的抗原亚型。

RT-PCR分型检测方法。随着cDNA克隆技术的发展与应用，呼吸道合胞病毒的核苷酸序列和氨基酸序列也研究的越来越清楚，呼吸道合胞病毒亚型之间以及同一呼吸道合胞病毒亚型内的抗原差异性从基因水平上也得到了证实。那么利用呼吸道合胞病毒G蛋白基因序列在不同亚型间具有高度变异性，而同亚间相对保守的特性，我们可以建立PCR的检测方法，能够快速特异的来检测临床标本中的呼吸道合胞病毒，同时呢又能对呼吸道合胞病毒阳性标本呢来进行分型。

RT-PCR。1998年朱汝南等参考国外文献，利用呼吸道合胞病毒G蛋白基因在不同的亚间高度变异这一特点，设计并建立了用逆转录-聚合酶链反应来鉴别呼吸道合胞病毒亚型的方法。他这一篇文章呢发表在《中华儿科》杂志1998年36卷第9期。

这就是他这篇文章的主要内容，他主要是参考呼吸道合胞病毒A和B亚型原型株Long株和CH18537株的G 蛋白编码基因的核苷酸序列，设计3个引物，P1、P2和P3。P1呢是根据G蛋白基因5 ' 端核苷酸的序列设计，由于此处呢A、B亚型间高度保守，因此呢为A、B亚型的通用引物。P2和P3呢分别位于核苷酸的3 '端，它分别与A亚型和B亚型互补，这样呢与P1呢可以共同扩增出277个bp的A亚型片断，或者是与P1呢扩增出B亚型的863个bp的片断。PCR扩等产物在琼脂糖凝胶中进行电泳，然后根据条带的大小，就可以判定A、B亚型。

巢式PCR检测方法，就是先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量，然后呢再用一对内引物扩增以得到特异的PCR产物，这种方法就是巢式PCR的检测方法。

首都儿科研究所的赵林清呢曾经进行过呼吸道合胞病毒检测方法的比较，他就尝试过用呼吸道合胞病毒A、B亚型原型株Lang株和18537G蛋白编码基因的核苷酸序列设计了巢式PCR引物，一共是6个引物，前3个引物呢为一次PCR引物，后3个引物为二次PCR引物。最后呢是通过扩增呢，如果是A亚型毒株呢可以扩增