核酸与蛋白质的分离与纯化
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由于反复冻融产生的机械剪切力对核酸样品有断裂作用，在实际保存时， 最好将核酸制品小量分装保存。
2 DNA的分离与纯化
基因组DNA的分离与纯化 质粒DNA的分离与纯化 DNA片段的回收
核酸分离与纯化的基本原则 核酸分离与纯化的技术路线
核酸简介
核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3’, 5’—磷酸二酯键连接成的一类生物大
分子，包括核糖核酸RNA和脱氧核糖核酸DNA两类。
真核生物
染色体DNA (细胞核,内双链线状)
细胞器DNA (线粒体或叶绿体,双链环状)
原核生物
染色体DNA (双链环状)
核酸分离与纯化的基本原则 核酸分离与纯化的技术路线
核酸分离与纯化的技术路线
主要技术路线
核酸的释放
核酸的浓缩、沉淀与洗涤
核酸的分离与纯化
核酸鉴定与保存
核酸分离与纯化的技术路线
1 核酸的释放
核酸分离纯化的第一步就是裂解细胞，释放核酸。
破碎细胞方法
机械法 非机械法
固体剪切作用
液体剪切作用 干燥法 溶胞法
只用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液
UV2450/2550 岛津紫外可见分光光度计系列
核酸分离与纯化的技术路线
（2）荧光光度法
原理： 荧光染料溴化乙锭（EB），可嵌入到碱基平面， 而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。
特点： 适用于低浓度核酸溶液的定量分析, 高灵敏度：1-5 ng，但具有强致癌性
珠磨法 压榨
高压均浆 超声破碎 酶溶法 化学法 物理法
机械法不适合真核基因组DNA，非机械法中溶胞法应用最广泛
核酸分离与纯化的技术路线 2 核酸的分离与纯化
复杂的混合物中纯化核酸时，清除的主要杂质包括三部分：
分离纯化步骤越多，核酸纯度高但得率低；分离纯化步骤越简化，得率高纯度低。 核酸分离纯化的方法应结合核酸制备的用途加以合适设计。
核酸分离与纯化的技术路线；
4 核酸的鉴定-完整性鉴定
核酸凝胶电泳法：以溴化乙锭为示踪剂，结果可判定核酸制品的完整性。
总RNA电泳，观测各条带的含量， 提示是否存在RNA降解；如加样 槽中存在条带，可能是DNA污染。
基因组DNA电泳，在电场中 泳动慢，如果发生降解，可 出现电泳图谱脱尾现象
正常时，28SRNA的荧 光强度约为18SRNA的 2 倍 ， 否 则 提 示 RNA 的 降解。
蛋白质是生物功能的执行者，具有生物催化、物质运输、防 御、调控等多种生理功能。
得到高度纯化，同时具有生物活性的目标物质是研究核酸和蛋白质的 关键问题。
因此，核酸及蛋白质的分离纯化技术起到决定性作用。
1 核酸分离与纯化的基本原则及技术路线
核酸分离与纯化的基本原则 核酸分离与纯化的技术路线
1 核酸分离与纯化的基本原则及技术路线
（2）核酸的沉淀与洗涤
沉淀是浓缩核酸最常用且高效的方法。 沉淀的特点 1.易将核酸溶液调至所需浓度 2.改变溶解核酸的缓冲液种类 3.去除部分杂质与某些盐离子 可选择有机溶剂沉淀核酸 加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后可用有机溶剂（如乙醇、 异丙醇等）沉淀核酸，少量共沉淀的盐，可使用70~75%的乙醇洗涤。
核酸分离与纯化的技术路线
3 核酸的浓缩、沉淀与洗涤
（1）核酸的浓缩
核酸浓缩常选用有机溶剂沉淀法 ①固体聚乙二醇（PEG）浓缩 将DNA溶液装入透析袋，包埋于PEG使DNA脱水。 ②丁醇抽提浓缩 正丁醇或仲丁醇具有吸水能力，但DNA不溶于丁醇，振荡 混合后离心，去除有机相，可显著减少DNA体积。
核酸分离与纯化的技术路线
核酸分离与纯化的技术路线
4 核酸的鉴定-浓度鉴定
（1）紫外分光光度法
测定DNA在A260nm的光吸收值
如计算DNA浓度
UVmini1240
A260×稀释倍数×50＝ μg/ml
(DNA样品含有盐，会使A260偏高，此时需测A310 以扣除 背景，并以A260与A310差值作为定量计算的依据）
UV1700
荧光光度法
核酸分离与纯化的技术路线
4 核酸的鉴定-纯度鉴定
（1）紫外分光光度法
A260 /A280 的比值来判定有无蛋白质污染和鉴定核酸纯度的重要指标。 纯的DNA A260与A280之比应在1.8 纯的RNA A260与A280之比应在2.0
（2）荧光光度法
用溴化乙锭等荧光染料示踪的核酸电泳结果进行评定。
核酸分离与纯化的技术路线
5 核酸的保存
（1）DNA的保存
TE缓冲液中-70℃保存数年 TE缓冲液的 pH与DNA 贮存有关，pH为8.0时，可减少
DNA脱氨反应，pH低于7.0时DNA容易变性。 在DNA溶液中加少量氯仿可有效防止细菌和核酸的污染
（2）RNA的保存
可溶于0.3mol/L的醋酸钠溶液，-70℃保存 可溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，-20 ℃保存。 以焦碳酸二乙酯水溶解可抑制RNA酶对RNA的降解。
质粒DNA (双链环状)
Βιβλιοθήκη Baidu
核酸分离与纯化的基本原则
1 保持核酸结构的完整性
控制缓冲液酸碱度：pH 4~10 注意机械剪切力 提取温度：0~4度 注意核酸酶
2 尽量排除其他分子的污染
蛋白质、多糖和脂质这类生物大分子杂质 对酶有抑制作用的有机溶剂和高浓度的金属离子 其他核酸分子
1 核酸分离与纯化的基本原则及技术路线
本章课程内容
1 核酸分离与纯化的基本原则及技术路线 2 DNA的分离与纯化 3 RNA的分离与纯化 4 蛋白质的分离与纯化
前言
从分子水平上认识生命的现象已经成为现代生物科学发展的主要方向，核 酸和蛋白质作为体内最重要的生物大分子，是生命体结构和功能的重要基础。
核酸是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。包括DNA（脱氧 核糖核酸）和RNA（核糖核酸）。而基因是控制生物遗传结构和功能 的基本单位，是有遗传效应的DNA片段。
核酸与蛋白质的分离与纯化
2015年1月20日，美国总统奥巴马在国情演讲中启动精准医疗计 划。精准医疗是以个体化医疗为基础、随着基因组测序技术快速 进步以及生物信息与大数据科学的交叉应用而发展起来的新型医 学概念与医疗模式。
课程要求
掌握 DNA、RNA及蛋白质的分离与纯化原理 熟悉 分离与纯化核酸与蛋白质的注意事项 了解 核酸与蛋白质分离与纯化技术的应用前景
2 DNA的分离与纯化
基因组DNA的分离与纯化 质粒DNA的分离与纯化 DNA片段的回收
核酸分离与纯化的基本原则 核酸分离与纯化的技术路线
核酸简介
核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3’, 5’—磷酸二酯键连接成的一类生物大
分子，包括核糖核酸RNA和脱氧核糖核酸DNA两类。
真核生物
染色体DNA (细胞核,内双链线状)
细胞器DNA (线粒体或叶绿体,双链环状)
原核生物
染色体DNA (双链环状)
核酸分离与纯化的基本原则 核酸分离与纯化的技术路线
核酸分离与纯化的技术路线
主要技术路线
核酸的释放
核酸的浓缩、沉淀与洗涤
核酸的分离与纯化
核酸鉴定与保存
核酸分离与纯化的技术路线
1 核酸的释放
核酸分离纯化的第一步就是裂解细胞，释放核酸。
破碎细胞方法
机械法 非机械法
固体剪切作用
液体剪切作用 干燥法 溶胞法
只用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液
UV2450/2550 岛津紫外可见分光光度计系列
核酸分离与纯化的技术路线
（2）荧光光度法
原理： 荧光染料溴化乙锭（EB），可嵌入到碱基平面， 而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。
特点： 适用于低浓度核酸溶液的定量分析, 高灵敏度：1-5 ng，但具有强致癌性
珠磨法 压榨
高压均浆 超声破碎 酶溶法 化学法 物理法
机械法不适合真核基因组DNA，非机械法中溶胞法应用最广泛
核酸分离与纯化的技术路线 2 核酸的分离与纯化
复杂的混合物中纯化核酸时，清除的主要杂质包括三部分：
分离纯化步骤越多，核酸纯度高但得率低；分离纯化步骤越简化，得率高纯度低。 核酸分离纯化的方法应结合核酸制备的用途加以合适设计。
核酸分离与纯化的技术路线；
4 核酸的鉴定-完整性鉴定
核酸凝胶电泳法：以溴化乙锭为示踪剂，结果可判定核酸制品的完整性。
总RNA电泳，观测各条带的含量， 提示是否存在RNA降解；如加样 槽中存在条带，可能是DNA污染。
基因组DNA电泳，在电场中 泳动慢，如果发生降解，可 出现电泳图谱脱尾现象
正常时，28SRNA的荧 光强度约为18SRNA的 2 倍 ， 否 则 提 示 RNA 的 降解。
蛋白质是生物功能的执行者，具有生物催化、物质运输、防 御、调控等多种生理功能。
得到高度纯化，同时具有生物活性的目标物质是研究核酸和蛋白质的 关键问题。
因此，核酸及蛋白质的分离纯化技术起到决定性作用。
1 核酸分离与纯化的基本原则及技术路线
核酸分离与纯化的基本原则 核酸分离与纯化的技术路线
1 核酸分离与纯化的基本原则及技术路线
（2）核酸的沉淀与洗涤
沉淀是浓缩核酸最常用且高效的方法。 沉淀的特点 1.易将核酸溶液调至所需浓度 2.改变溶解核酸的缓冲液种类 3.去除部分杂质与某些盐离子 可选择有机溶剂沉淀核酸 加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后可用有机溶剂（如乙醇、 异丙醇等）沉淀核酸，少量共沉淀的盐，可使用70~75%的乙醇洗涤。
核酸分离与纯化的技术路线
3 核酸的浓缩、沉淀与洗涤
（1）核酸的浓缩
核酸浓缩常选用有机溶剂沉淀法 ①固体聚乙二醇（PEG）浓缩 将DNA溶液装入透析袋，包埋于PEG使DNA脱水。 ②丁醇抽提浓缩 正丁醇或仲丁醇具有吸水能力，但DNA不溶于丁醇，振荡 混合后离心，去除有机相，可显著减少DNA体积。
核酸分离与纯化的技术路线
核酸分离与纯化的技术路线
4 核酸的鉴定-浓度鉴定
（1）紫外分光光度法
测定DNA在A260nm的光吸收值
如计算DNA浓度
UVmini1240
A260×稀释倍数×50＝ μg/ml
(DNA样品含有盐，会使A260偏高，此时需测A310 以扣除 背景，并以A260与A310差值作为定量计算的依据）
UV1700
荧光光度法
核酸分离与纯化的技术路线
4 核酸的鉴定-纯度鉴定
（1）紫外分光光度法
A260 /A280 的比值来判定有无蛋白质污染和鉴定核酸纯度的重要指标。 纯的DNA A260与A280之比应在1.8 纯的RNA A260与A280之比应在2.0
（2）荧光光度法
用溴化乙锭等荧光染料示踪的核酸电泳结果进行评定。
核酸分离与纯化的技术路线
5 核酸的保存
（1）DNA的保存
TE缓冲液中-70℃保存数年 TE缓冲液的 pH与DNA 贮存有关，pH为8.0时，可减少
DNA脱氨反应，pH低于7.0时DNA容易变性。 在DNA溶液中加少量氯仿可有效防止细菌和核酸的污染
（2）RNA的保存
可溶于0.3mol/L的醋酸钠溶液，-70℃保存 可溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，-20 ℃保存。 以焦碳酸二乙酯水溶解可抑制RNA酶对RNA的降解。
质粒DNA (双链环状)
Βιβλιοθήκη Baidu
核酸分离与纯化的基本原则
1 保持核酸结构的完整性
控制缓冲液酸碱度：pH 4~10 注意机械剪切力 提取温度：0~4度 注意核酸酶
2 尽量排除其他分子的污染
蛋白质、多糖和脂质这类生物大分子杂质 对酶有抑制作用的有机溶剂和高浓度的金属离子 其他核酸分子
1 核酸分离与纯化的基本原则及技术路线
本章课程内容
1 核酸分离与纯化的基本原则及技术路线 2 DNA的分离与纯化 3 RNA的分离与纯化 4 蛋白质的分离与纯化
前言
从分子水平上认识生命的现象已经成为现代生物科学发展的主要方向，核 酸和蛋白质作为体内最重要的生物大分子，是生命体结构和功能的重要基础。
核酸是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。包括DNA（脱氧 核糖核酸）和RNA（核糖核酸）。而基因是控制生物遗传结构和功能 的基本单位，是有遗传效应的DNA片段。
核酸与蛋白质的分离与纯化
2015年1月20日，美国总统奥巴马在国情演讲中启动精准医疗计 划。精准医疗是以个体化医疗为基础、随着基因组测序技术快速 进步以及生物信息与大数据科学的交叉应用而发展起来的新型医 学概念与医疗模式。
课程要求
掌握 DNA、RNA及蛋白质的分离与纯化原理 熟悉 分离与纯化核酸与蛋白质的注意事项 了解 核酸与蛋白质分离与纯化技术的应用前景