病毒中和抗体检测

病毒中和抗体检测

1.病毒TCID50检测

TCID50 是指组织培养物（细胞）半数致死剂量。它有几个性质我们必须明白：1）它表示的是计量，不是浓度；2）它是一个单位；3）它的值等于1，实际上问它的值等于多少是一个没有意义的问题，就像问km的值等于多少一样，如果非要说出的的值等于多少，那我们只能说它的值在任何情况下都等于1。理解这三个性质对于理解TCID50非常重要，但是这三个性质经常被误解，所以导致对TCID50的理解出现偏差。

首先我们来看一下这个表示法的意思：病毒滴度为108.2TCID50/ml 。它表示的是每ml病毒溶液里含有108.2个TCID50的病毒，这和氯化钠的浓度为4.5mol/L表示每L溶液中含有4.5个mol的氯化钠是一样的道理。经常可以听到人说我的病毒的TCID50是10x.x。这个说法是不科学的，应该说我这个溶液里含有10x.x个TCID50的病毒或者说我这个溶液的病毒滴度是10xx TCID50/ml。也可以说病毒的TCID50效价是10-x.x。

TCID50=10^5.64/0.1ml。即：将病毒悬液作10^5.64稀释后，接种细胞0.1ml，可以使50%的细胞产生CPE。（将病毒悬液作10^5.64稀释后，0.1ml中含1个TCID50，作其他一些实验时（如中和试验），一般常用100TCID50/0.1ml或者100TCID50/0.05ml）

本方法的优缺点:①.优点:出现阳性结果时间较短,且较明显;②.缺点:有时候,在用枪头吸出细胞生长液时,容易出现污染;

使用本方法时的注意事项:①.稀释病毒时,每做一个病毒稀释度都需要换枪头,减少浓度误差;

②.96孔板,每孔接种的细胞量:一般在此种测定病毒滴度的方法下,要将细胞密度适当调低,至少要比正常传代时低一些,否则细胞生长速度过快,未到7天则细胞出现死亡,对观察CPE不利.一般情况下,小塑料瓶(8-9ml液体为正常用量),培养长慢单层后,消化细胞,加入6ml培养液,吹匀,吸出其中的2ml,到另外的瓶子,在该瓶中加入14-16ml即可,如果不放心,可以用显微镜看一下,细胞数过多则补加培养液,少则补加剩余4ml的细胞悬液;

维持液,即病毒培养液,配方为:①.MEM+2%小牛血清+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHCO3; ②. MEM+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHCO3;两种维持液的不同在于是否有FBS(小牛血清).我个人曾经做过实验,在状态很好的细胞上接种病毒,分别使用两种不同的维持液,最终结果是一样的,没有什么不同,所以可以根据个人需要进行选择.另外,曾经请教过专门做中和实验的老师,他认为适当的FBS对细胞有保护作用,而且他说这是国外文献上的报道.

1）细胞准备

1.1 检查培养瓶中的单层细胞，以5ml胰酶－EDTA轻微冲洗

1.2 加入4－5ml 胰酶－EDTA以覆盖单层细胞

1.3 放平培养瓶，37℃5％CO2培养箱中孵育10－20min，直到细胞脱落

1.4 加入5－10ml培养液，洗下细胞后移到离心管中

1.5 以PBS洗细胞两次（12000rpm, 5min）

1.6 以D-MEM重悬细胞，并用血球计数板计数

1.7 以D-MEM将将细胞浓度调整到1×10^5/ml --1.5×10^5/ml

1.8 在微量培养板的各孔中加入100μl细胞, 相当于?×10^4细胞/孔

1.9 在37℃5％CO2培养箱中过夜培养（18－22h），用处于生长相刚达到完全融合的细胞进行病毒的滴定

2）病毒制备

3）病毒稀释

3.1 取冻存的病毒，以病毒生长培养液（VGM）稀释10倍，即100微升病毒液+900微升稀释液，共1毫升。（于1.5ML EP管中进行，将混合液充分吹打振荡，很重要！）

3.2 做10倍稀释

3.3 在另一新1.5ML EP管中加入100μl第一管稀释病毒液（1/10），按10的比例进行倍比稀释，再加入900μl稀释液，将混合液充分吹打振荡。以此类推共稀释至10^13倍。

此过程中需要使用加样器和tip头。使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌。使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）

4）病毒接种：

4.1 取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液或无血清DMEM加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。

4.2 于各孔中加100ul各不同的病毒稀释液，每个稀释度做一列孔，即每个病毒稀释度做8个平行复孔，根据观察的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度到原液加样。(病毒稀释度的选择10^3—10^12或者10^4—10^13,因为目的基因不同，重组腺病毒滴度差距很大，应该尽量将稀释度加大，看到有人用的稀释度是10^6—10^13)

4.3 第11列和12列为阴性对照，阴性对照孔中加入100ul含5%胎牛血清的DMEM，监测细胞存活情况；切记：设置正常的细胞对照。每次实验要重复4次，

4.4 37℃CO2培养箱中孵育1h，取出培养板吸去病毒液（从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔），加入维持液200µl继续于37℃，5% CO2培养5--10天；

4.5 逐日观察，5--10天后倒置显微镜下观察，计算每一列中出现CPE（cytopathic effects，CPEs）的孔数。只要有一小点或是一些细胞出现CPE即为阳性，如果无法确定，可与阴性对照比较；

4.6 如果阴性对照中无任何CPE且细胞生长良好，最低稀释度100%阳性而最高稀释度100%阴性，则本试验即为有效；

4.7 计算每一列中出现阳性的孔数；

4.8 用Reed-Muench法计算病毒TCID50/ml。

(1)计算各病毒稀释度阳性孔数目（1）和阴性孔数目（2）

(2)计算阳性和阴性孔的累积数。

阳性孔累积数由下向上累计（3）；阴性孔累积数由上向下累计（4）

(3)计算阳性孔的百分比：比率（5）=（3）/〔（3）+（4）〕，（6）=（5）×100

(4)计算

距离比例（PD）=（大于50%的阳性百分比－50）/（大于50%的阳性百分比－小于50%的阳性百分比）

TCID50的对数=大于50%的阳性百分比的最高稀释对数 + 距离比例×稀释系数的对数

（稀释系数的对数 1:10稀释为1，半对数稀释为0.5，倍比稀释为0.3，1:5稀释为0.7）

举例计算：TCID

50

的测定和计算（Reed-Muench法）

它们的累计数分别列于第四和第五列（根据箭头所示方向）,第六列为细胞管总数,第七列为出现细胞病变的细胞管数占细胞管总数的百分率。可见该病毒株的

TCID

50

在10-3（91.6％）和10-4（40％）之间,其确切稀释倍数可按下列公式计算：91.6（高于50％的百分数）-50 91.6（高于50％的百分数）-40（低于50％的百分数）

＝41.6/51.6＝0.8

将由上式获得0.8加在高于50%死亡的稀释度的对数（3）上,因此该病毒的TCID

50

应是0.1ml 10-3.8

稀释的病毒液。查反对数得6310,即该病毒6310倍稀释液

0.1ml等于1个TCID

50

。