蛋白质糖基化工程

蛋白质糖基化工程
赵洪亮　刘志敏
3
(军事医学科学院生物工程研究所　北京　100071)
摘要　糖基化是蛋白质的一种重要的翻译后修饰,对蛋白质的结构和功能有重要影响。

蛋白质
糖基化工程是通过对蛋白质表面的糖链进行改造,从而改良蛋白质性质的一种技术。

综述了蛋白质糖基化工程的原理、方法和应用。

关键词　蛋白质糖基化　糖基化工程　蛋白质改造
收稿日期:2003206212
3通讯作者,电话:010*********
1　蛋白质的糖基化及其作用
糖基化是蛋白质的一种重要的翻译后修饰[1]。

根据糖链和肽链的连接方式的不同,蛋白质的糖基化可分为N 2糖基化和O 2糖基化。

N 2糖基化是通过糖链的还原端的N 2乙酰氨基葡萄糖(G lc 2NAc )和肽链中某些Asn 侧链酰氨基上的氮原子相连。

能接有糖链的Asn 必须处于Asn 2X 2Ser ΠThr 3残基构成的基序(m otif )中,其中X 可为除Pro 的任意的氨基酸残基。

O 2糖基化的结构比N 2糖基化简单,一般糖链较短,但是种类比N 2糖基化多得多。

肽链中可以糖基化的主要是Ser 和Thr ,此外还有酪氨酸、羟赖氨酸和羟脯氨酸,连接的位点是这些残基侧链上的羟基氧原子。

蛋白质分子表面的糖链可对蛋白质分子的结构产生深远的影响,其主要的功能有:111　糖基化影响蛋白质分子的生物活性
对于某些蛋白质分子如人绒毛膜促性腺激素
(hCG )而言,糖基化是其发挥生物学活性必需的。

同时研究表明,改变蛋白质的糖基化还可以使蛋白
分子产生新的生物学活性[2]。

112　糖基化增加蛋白质的稳定性
糖基化可增加蛋白质对于各种变性条件(如变
性剂、热等)的稳定性[3]
,防止蛋白质的相互聚集[4]。

同时,蛋白质表面的糖链还可覆盖蛋白质分子中的某些蛋白酶降解位点,从而增加蛋白质对于
蛋白酶的抗性[5]。

113　糖基化与蛋白质的免疫原性
一方面,蛋白质表面的糖链可诱发特定的免疫
反应,另一方面,糖链又可遮盖蛋白质表面的某些表位从而降低其免疫原性。

114　糖基化与分子识别
长期以来,细胞表面的糖链被认为是“分子天线”参与细胞识别。

研究表明,糖链还参与抗原与抗体[6]及抗体Fc 段与其受体FcR 的相互识别[7]。

115　糖基化与蛋白质的可溶性
研究表明,蛋白质表面的糖链可增加蛋白质分
子的溶解性[8]。

116　糖基化影响蛋白质的转运
蛋白质表面的糖可作为蛋白分子的胞内定位信号,如糖蛋白N 2糖链经修饰,带有甘露糖262磷酸后,这些糖蛋白(多数是水解酶)就被分拣和投递到
溶酶体中。

糖基化还可增加糖蛋白的分泌效率[9]。

117　糖基化影响治疗用蛋白的疗效
对于治疗用蛋白,糖基化还可影响蛋白药物在
体内的半衰期[10]和靶向性[11]。

2　蛋白质糖基化工程
所谓蛋白质糖基化工程,就是通过对蛋白质表面的糖链进行改造,从而改良蛋白质性质的一种技术。

常用的对糖链进行改造的方法有:(1)通过定点突变技术增加或减少蛋白质的糖基化位点,从而增加或减少蛋白质表面的糖链。

(2)在体外通过
化学[2]或酶法[12]
对糖链进行修饰。

(3)细胞内由一系列糖苷酶和糖基转移酶组装成糖基化途径(glycosylation pathway )来催化蛋白质的糖基化。

通
第23卷第9期
中　国　生　物　工　程　杂　志
CHI NA BI OTECH NO LOGY
2003年9月
过基因工程手段改变宿主细胞内糖基化途径中糖苷酶和糖基转移酶的表达,即可改变在该系统中表达的糖蛋白的糖基化形式。

目前已通过该方式对酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母[13]、昆虫细胞[14]、CH O 细胞[7]及转基因植物[15]等多个表达系统进行了糖基化工程的改造。

(4)研究表明,糖基化还受到细胞培养条件的影响[16]。

可通过改变细胞培养过程中培养基的糖分、激素及氨离子浓度等条件来改变蛋白质的糖基化。

3　蛋白质糖基化工程的应用
311　通过糖基化工程增加重组蛋白药物的半衰期[10]
促红细胞生成素(EPO)是一种调节红系祖细胞生长的细胞因子。

EPO是一个高度糖基化的含唾液酸的酸性糖蛋白,由165个氨基酸组成,其成分约有60%蛋白质和40%糖(重量百分比)。

EPO 含3个N2糖链和1个O2糖链。

研究表明EPO的糖基化不影响其体外生物学活性,但却可延长体内半衰期。

受此启发,Amgen公司的科学家发明了一种新型的促红细胞生成蛋白(novel erythropoiesis stimulating protein,NESP)。

与EPO相比,NESP在33和88位各增加了1个N2糖基化位点。

NESP的体内半衰期是EPO的3倍,从而达到了减少用药次数的目的。

312　通过糖基化工程提高重组蛋白药物的靶向性[11]
高歇氏(G aucher’s)病是一种由葡糖脑苷脂酶基因缺陷而引起的单基因遗传性疾病。

葡糖脑苷脂酶是一种存在于溶酶体内的与溶酶体膜结合的糖蛋白,其底物为葡糖脑苷脂。

虽然葡糖脑苷脂酶在人体的各种类型的细胞都有表达,但由于该酶缺陷而造成的底物的堆积却只限于网状内皮系统的巨噬细胞。

这种异常的巨噬细胞被称为高歇氏细胞。

高歇氏细胞随血液循环转移到肝、脾、骨骼等器官后,使相应的器官发生病变,从而产生肝脾肿大、骨骼疼痛、贫血、血小板减少等各种病理症状。

高歇氏病是最常见的溶酶体积蓄病,其发病率与血友病相近。

1965年,Braddy提出:如果向患者体内补充葡糖脑苷脂酶,降解高歇氏细胞内堆积的葡糖脑苷脂,就有可能使以上症状得到控制或消除。

这就是高歇氏病的酶替代疗法。

但初步的临床试验结果表明葡糖脑苷脂酶缺乏良好的针对巨噬细胞的靶向性。

静脉注射葡糖脑苷脂酶后,90%的酶都被肝细胞摄取,因此只能取得有限的疗效。

针对巨噬细胞的靶向性问题成了酶替代疗法亟需解决的关键问题。

1980年,Stahl发现巨噬细胞表面有一种被称为甘露糖受体的膜蛋白。

这种膜蛋白能够特异性地结合糖链末端为甘露糖的糖蛋白,并将它内吞入胞。

而从胎盘中提取的和CH O系统表达的人葡糖脑苷脂酶的糖基化主要是以唾液酸为末端的复杂型的糖基化,因此不能有效地与甘露糖受体结合。

为了使葡糖脑苷脂酶能够有效地被巨噬细胞通过其表面的甘露糖受体摄取,G enzyme公司依次用唾液酸苷酶、β2半乳糖苷酶、β2N2乙酰氨基己糖苷酶来处理人葡糖脑苷脂酶,使其暴露出甘露糖残基,从而增加了人葡糖脑苷脂酶针对巨噬细胞的靶向性,使得高歇氏病的酶替代疗法取得了良好的疗效。

313　通过糖基化工程提高抗体分子的效应功能(effector functions)[7]
抗体与抗原结合后在少数情况下可对机体直接提供保护作用,如中和毒素的或抑制病毒对宿主细胞的感染等。

但大多数情况下需要通过效应功能灭活或清除外来抗原以保护机体。

抗体的效应功能是由抗体重链恒定区(Fc)介导的,可造成靶细胞的杀伤,促进细胞吞噬作用,诱发生物活性物质的释放,引起炎症反应等一系列生物学效应。

引起效应功能的机制可分为两类:一类是通过补体激活,另一类是通过抗体分子Fc段与各种细胞膜表面Fc受体相互作用。

研究表明,抗体分子Fc段297位Asn上的寡糖链参与Fc与其受体的相互作用,进一步研究还发现寡糖链的类型对于Fc与其受体的亲合力有重要影响。

N2乙酰氨基葡萄糖转移酶III(G nT III)催化N2乙酰氨基葡萄糖以beta124糖苷键连接至N2糖链甘露糖核心中的处于中心位置的甘露糖中。

抗体分子的这种糖链修饰方式仅限于人类的IgG中,并且与抗体的效应功能密切相关。

最近,研究者在CH O细胞中共表达了G nT III和抗C D20的工程抗体美罗华(Rituxan)。

经研究发现美罗华与Fc gammaR的亲合力及抗体介导的细胞毒作用(ADCC)提高了10～20倍,显示了良好的应用前景。

91
第9期赵洪亮等:蛋白质糖基化工程
314　通过糖基化工程提高蛋白质分子对于蛋白酶的抗性[5]
粒细胞集落刺激因子(G2CSF)是由174个氨基酸组成的糖蛋白,具有促进粒系造血干细胞增殖分化及增强成熟细胞功能的作用。

G2CSF突变体G2CSF(N28D)具有比野生型G2 CSF更高的活性,但是其第8位和第144位氨基酸残基易被各种蛋白酶降解而失活。

研究者通过定点突变技术在G2CSF(N28D)的第6位和第145位氨基酸残基引入N2糖基化位点后发现其蛋白酶抗性大大提高了。

4　蛋白质糖基化工程的发展前景
长期以来由于糖类结构的高度复杂性,使得关于糖类的研究远远落后于蛋白质和核酸的研究。

这在很大程度上制约了蛋白质糖基化工程的发展。

近年来,随着糖生物学的发展,在糖链的化学和酶促合成,糖链的结构分析等领域取得了突破性进展[17]。

蛋白质糖基化工程作为一种新型的改良蛋白质性质的手段必然会在蛋白质的改造中发挥越来越重要的作用。

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Protein G lycoengineering
Zhao H ongliang　Liu Zhimin
(Beijing Institute of Biotechnology　Beijing　100071)
Abstract　G lycosylation is the m ost im portant post2translational m odification of protein.The covalently bound olig osaccharides play a significant role in the structure and function of protein.Protein glycoengineering is a newly developed technology that aims at im proving the protein properties through the m odification of its glycosylation.The principle,technique and application of protein glycoengineering were reviewed.
K ey w ords　Protein glycosylation　G lycoengineering　Protein im provement
02中　国　生　物　工　程　杂　志第23卷。