摘要及结果HX

硕士学位论文

详细摘要与主要结果

一种心叶烟内源性沉默抑制子的鉴定及功能分析Identification and Functional Analysis of an Endogenous Suppressor of RNA Silencing from Nicotiana glutinosa

考生姓名：黄旭

报考学院：生命科学学院

报考专业：人类和医学分子遗传学

报考导师：张锋

中文摘要

RNA沉默是一种普遍存在真核生物体内用以抵抗病毒和外来核酸入侵的特异性RNA降解机制。针对这一防御机制，病毒通过编码沉默抑制子干扰RNA 沉默，保证其成功侵染。越来越多的研究表明植物本身也编码内源性沉默抑制子参与RNA沉默的调控。这种对RNA沉默起负调控作用的内源蛋白的作用机制还不明确。本研究利用农杆菌瞬时表达系统，首次鉴定TMV诱导的心叶烟富含甘氨酸的RNA结合蛋白NgRBP为内源性沉默抑制子，同时对其RNA沉默抑制的分子机制进行了初步的分析。主要研究结果如下：

(1)心叶烟NgRBP基因的表达模式分析。对NgRBP基因表达分析表明，NgRBP在心叶烟的根、茎、花、叶中均有表达，但在根和茎中的表达量明显高于花和叶。为进一步分析其表达模式，通过反向PCR克隆到NgRBP启动子区域982 bp的序列，PlantCare序列的分析表明，NgRBP启动子区域有1个ABA 响应的顺势作用元件、1个MeJA响应的顺势作用元件和2个光响应的顺势作用元件。Northern blot表明，NgRBP的表达的确受ABA和MeJA的诱导，在喷施ABA后，NgRBP的表达量在8 h时达到峰值，从12 h后逐渐下降。而喷施MeJA 后，NgRBP的表达量在0-24 h之间呈逐渐递增趋势。

(2)NgRBP抑制局部和系统性沉默。NgRBP和GFP在本生烟16c中共表达，其侵染的区域在第3天和第6天都有较强的GFP表达，GFP mRNA 的积累量水平较高，而GFP siRNA 却几乎检测不到。在侵染后第13天，侵染空载体的植株的新生叶片沿着叶脉变红表明已发生系统性沉默，而NgRBP共侵染植株上部新生叶片依然保持较强的GFP荧光，GFP mRNA 的积累量明显高于侵染空载体

的植株。NgRBP既能抑制单链RNA引发的沉默也能抑制由dsRNA诱发的沉默，由此推测，NgRBP可能作用在dsRNA形成的下游阶段。

(3)利用TRV载体介导的病毒诱导的基因沉默系统，研究NgRBP基因与植株病毒抗性的关系。为了更进一步研究NgRBP基因在抗病毒反应中的作用，我们利用TRV病毒载体沉默NgRBP基因在心叶烟中的表达。RT-PCR结果表明，TRV载体介导的基因沉默体系在心叶烟能够有效地抑制内源基因的表达。随后，我们在对照植株和沉默植株分别接种PVX和CMV病毒。在接种病毒10天后，通过病状观察和台盼蓝染色都证明，对照植株的发病情况要重于沉默植株。Northern blot检测表明，对照植株中病毒RNA的积累量稍高于沉默植株的，表明NgRBP基因在心叶烟的抗病毒反应起负调控作用。

(4)NgRBP蛋白与siRNA的亲和力分析。为探究其抑制沉默的方式是否是通过结合siRNA，我们利用凝胶阻滞迁移实验检测NgRBP和siRNA的亲和力。实验结果表明，浓度梯度递增的NgRBP蛋白均不结合siRNA，而作为阳性对照的NS1蛋白对siRNA表现出很强的亲和力。

(5)异源表达NgRBP基因的拟南芥miRNA的表达量显著降低。为了探究NgRBP是否干扰miRNA途径，我们在拟南芥中异源表达NgRBP。定量结果表明，所检测的miRNAs在转基因植株中的表达量均低于野生型。为解析其分子机理，我们检测了miRNA 途经中两个关键基因AGO1和DCL1的表达量。其中AGO1基因的表达量在野生型和转基因植株中没有显著性差别，而DCL1基因的表达量在野生型中是转基因植株的近2倍。因此，我们推断转基因植株miRNAs

表达量的降低是由于DCL1基因的表达量降低，导致miRNAs的前体不能高效剪切为成熟的miRNAs。

关键词：RNA沉默；内源性沉默抑制子；心叶烟；NgRBP；农杆菌瞬时侵染

Abstract

RNA silencing is a kind of sequence-specific degradation mechanism commonly found in eukaryotic organisms to resist the invasion of viruses and heterologous nucleic acid. To counteract host defense, many plant viruses encode viral suppressors of RNA silencing (VSRs) that target different steps of RNA silencing pathway to guarantee their successful invasion. Growing evidences show that plants also encode endogenous suppressors of RNA silencing (ESRs) that participate in appropriate regulation of RNA silencing. The mechanism of action of such endogenous negative regulators of RNA silencing to thwart host defense is intriguing but remain obscure. In this study, we characterized NgRBP, a glycine-rich RNA binding protein (GR-RBP) from Nicotiana glutinosa, as a novel ESR using Agrobacterium infiltration assays. Further more, the mechanism of action of NgRBP acts as an ESR was preliminarily analyzed. The main research results are as follows:

(1) Expression profiles of NgRBP gene in N. glutinosa plants. Our results of the tissue-specific expression of NgRBP gene in N. glutinosa indicated that NgRBP gene is constitutively expressed in all examined organs, and obviously expressed at higher levels in root and stem compared with leaf and flower.To further study the expression regulation of NgRBP gene, a 982 bp fragment of its 5′-flanking region was isolated using inverse PCR technique. The sequence was analyzed with the PlantCARE database and three types of cis-acting element were predicted to be related to environment response: one abscisic acid (ABA)-responsive element, one methyl jasmonate (MeJA)-responsive element and two light-responsive elements.Expression