摘要及结果HX

硕士学位论文
详细摘要与主要结果
一种心叶烟内源性沉默抑制子的鉴定及功能分析Identification and Functional Analysis of an Endogenous Suppressor of RNA Silencing from Nicotiana glutinosa
考生姓名：黄旭
报考学院：生命科学学院
报考专业：人类和医学分子遗传学
报考导师：张锋
中文摘要
RNA沉默是一种普遍存在真核生物体内用以抵抗病毒和外来核酸入侵的特异性RNA降解机制。

针对这一防御机制，病毒通过编码沉默抑制子干扰RNA 沉默，保证其成功侵染。

越来越多的研究表明植物本身也编码内源性沉默抑制子参与RNA沉默的调控。

这种对RNA沉默起负调控作用的内源蛋白的作用机制还不明确。

本研究利用农杆菌瞬时表达系统，首次鉴定TMV诱导的心叶烟富含甘氨酸的RNA结合蛋白NgRBP为内源性沉默抑制子，同时对其RNA沉默抑制的分子机制进行了初步的分析。

主要研究结果如下：
(1)心叶烟NgRBP基因的表达模式分析。

对NgRBP基因表达分析表明，NgRBP在心叶烟的根、茎、花、叶中均有表达，但在根和茎中的表达量明显高于花和叶。

为进一步分析其表达模式，通过反向PCR克隆到NgRBP启动子区域982 bp的序列，PlantCare序列的分析表明，NgRBP启动子区域有1个ABA 响应的顺势作用元件、1个MeJA响应的顺势作用元件和2个光响应的顺势作用元件。

Northern blot表明，NgRBP的表达的确受ABA和MeJA的诱导，在喷施ABA后，NgRBP的表达量在8 h时达到峰值，从12 h后逐渐下降。

而喷施MeJA 后，NgRBP的表达量在0-24 h之间呈逐渐递增趋势。

(2)NgRBP抑制局部和系统性沉默。

NgRBP和GFP在本生烟16c中共表达，其侵染的区域在第3天和第6天都有较强的GFP表达，GFP mRNA 的积累量水平较高，而GFP siRNA 却几乎检测不到。

在侵染后第13天，侵染空载体的植株的新生叶片沿着叶脉变红表明已发生系统性沉默，而NgRBP共侵染植株上部新生叶片依然保持较强的GFP荧光，GFP mRNA 的积累量明显高于侵染空载体
的植株。

NgRBP既能抑制单链RNA引发的沉默也能抑制由dsRNA诱发的沉默，由此推测，NgRBP可能作用在dsRNA形成的下游阶段。

(3)利用TRV载体介导的病毒诱导的基因沉默系统，研究NgRBP基因与植株病毒抗性的关系。

为了更进一步研究NgRBP基因在抗病毒反应中的作用，我们利用TRV病毒载体沉默NgRBP基因在心叶烟中的表达。

RT-PCR结果表明，TRV载体介导的基因沉默体系在心叶烟能够有效地抑制内源基因的表达。

随后，我们在对照植株和沉默植株分别接种PVX和CMV病毒。

在接种病毒10天后，通过病状观察和台盼蓝染色都证明，对照植株的发病情况要重于沉默植株。

Northern blot检测表明，对照植株中病毒RNA的积累量稍高于沉默植株的，表明NgRBP基因在心叶烟的抗病毒反应起负调控作用。

(4)NgRBP蛋白与siRNA的亲和力分析。

为探究其抑制沉默的方式是否是通过结合siRNA，我们利用凝胶阻滞迁移实验检测NgRBP和siRNA的亲和力。

实验结果表明，浓度梯度递增的NgRBP蛋白均不结合siRNA，而作为阳性对照的NS1蛋白对siRNA表现出很强的亲和力。

(5)异源表达NgRBP基因的拟南芥miRNA的表达量显著降低。

为了探究NgRBP是否干扰miRNA途径，我们在拟南芥中异源表达NgRBP。

定量结果表明，所检测的miRNAs在转基因植株中的表达量均低于野生型。

为解析其分子机理，我们检测了miRNA 途经中两个关键基因AGO1和DCL1的表达量。

其中AGO1基因的表达量在野生型和转基因植株中没有显著性差别，而DCL1基因的表达量在野生型中是转基因植株的近2倍。

因此，我们推断转基因植株miRNAs
表达量的降低是由于DCL1基因的表达量降低，导致miRNAs的前体不能高效剪切为成熟的miRNAs。

关键词：RNA沉默；内源性沉默抑制子；心叶烟；NgRBP；农杆菌瞬时侵染
Abstract
RNA silencing is a kind of sequence-specific degradation mechanism commonly found in eukaryotic organisms to resist the invasion of viruses and heterologous nucleic acid. To counteract host defense, many plant viruses encode viral suppressors of RNA silencing (VSRs) that target different steps of RNA silencing pathway to guarantee their successful invasion. Growing evidences show that plants also encode endogenous suppressors of RNA silencing (ESRs) that participate in appropriate regulation of RNA silencing. The mechanism of action of such endogenous negative regulators of RNA silencing to thwart host defense is intriguing but remain obscure. In this study, we characterized NgRBP, a glycine-rich RNA binding protein (GR-RBP) from Nicotiana glutinosa, as a novel ESR using Agrobacterium infiltration assays. Further more, the mechanism of action of NgRBP acts as an ESR was preliminarily analyzed. The main research results are as follows:
(1) Expression profiles of NgRBP gene in N. glutinosa plants. Our results of the tissue-specific expression of NgRBP gene in N. glutinosa indicated that NgRBP gene is constitutively expressed in all examined organs, and obviously expressed at higher levels in root and stem compared with leaf and flower.To further study the expression regulation of NgRBP gene, a 982 bp fragment of its 5′-flanking region was isolated using inverse PCR technique. The sequence was analyzed with the PlantCARE database and three types of cis-acting element were predicted to be related to environment response: one abscisic acid (ABA)-responsive element, one methyl jasmonate (MeJA)-responsive element and two light-responsive elements.Expression
profiles analysis by Northern blot proved that the NgRBP transcripts reached peak level at 8 h and gradually decreased at 12 h in N. glutinosa leaves after ABA treatment. However,treatment with MeJA increased the NgRBP expression gradually from 4 to 24 h after exposure.
(2) NgRBP blocks both local and systemic RNA silencing. In patches coinfiltrated with 35S-NgRBP plus 35S-GFP, the green fluorescence intensity was strong and the GFP mRNA levels was significantly increased, however, the accumulation of GFP-specific siRNAs was drastically reduced to an undetected levels at both 3 and 6 dpi. In addition, our results also indicated that NgRBP could suppress the systemic RNA silencing.At 12 dpi, systemic GFP silencing occurred with vein-proximal red appeared in the plants infiltrated with 35S-GFP alone. Whereas most of the new emerge leaves of plants infiltrated with 35S-NgRBP plus 35S-GFP still maintained GFP fluorescence, and the levels of steady-state GFP mRNA in the new emerge leaves significantly higher than that from leaves coinfiltrated with 35S-GFP alone. The fact that NgRBP suppressed RNA silencing induced by sense RNA or dsRNA indicates that NgRBP targets a downstream step of dsRNA formation in the RNA silencing pathway.
(3)The study of the relationship between NgRBP gene and virus resistance using Tobacco rattle virus(TRV)-based virus induced gene silencing (VIGS).To investigate the role of NgRBP gene in plant defense responses, we knocked down NgRBP gene using the TRV-based VIGS technique. Reverse transcription PCR (RT-PCR) analysis revealed that TRV-based VIGS could effectively silenced the
endogenous genes expression in N. glutinosa plants. Then the systemically NgRBP-silenced plants and the empty vector control plants were used for inoculation with PVX and CMV, respectively. The visible symptom and trypan blue staining all revealed that the empty control plants exhibited more severe symptoms than that of NgRBP-silenced plants at 10 dpi. Northern blot analysis shown that the steady state levels of PVX genomic RNA and CMV RNA2 were accumulated to a higher level in the control plants than in NgRBP-silenced plants, indicating that the NgRBP gene acts as a negative regulator in the antiviral response of N. glutinosa plants.
(4) Analysis of the affinity of NgRBP and siRNA. To analyze whether NgRBP exerts its suppressor function by binding siRNA, electrophoretic mobility shift assays (EMSA) was carried out. The results indicated that biotin labeled 21-nt siRNA duplexes showed no affinity to His-fused NgRBP (His–NgRBP) with the increasing concentrations. However, as positive control, NS1 of influenza A virus binds siRNAs strongly.
(5) Expression of NgRBP in Arabidopsis significantly decreases the accumulation levels of miRNAs. To test the effect of NgRBP on miRNA pathway, we developed a transgenic Arabidopsis expressed the NgRBP gene. Our results revealed that ectopic expression of NgRBP in Arabidopsis significantly decreased the accumulation of all tested miRNAs compared with wild-type (WT) plants. To elucidate the molecular basis by which NgRBP-mediated the reduction of miRNA accumulation, the expression levels of two representative genes involved in miRNA pathway were examined. No significant difference was detected in the AGO1 mRNA between
NgRBP-expressing plants and WT plants. However, analysis showed that the DCL1 mRNA was reduced at least 2-fold in NgRBP-expressing plants compared with WT plants. Therefore, we speculate that a downregulated DCL1expression leads to miRNAs level decreasing due to the inefficient processing of miRNA precursors. Key words: RNA silencing; endogenous suppressors of RNA silencing; Nicotiana glutinosa; NgRBP; Agrobacterium-mediated transient expression assays
结果与分析
1.基因克隆与载体构建
1.1 目的基因的克隆
利用Trizol法从心叶烟中提取RNA，返转录之后得cDNA, 再以cDNA为模板，用NgRBP基因的特异性引物进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳可见471bp 的特异性扩增条带（图1A），与理论大小相符。

1.2 克隆载体的构建
凝胶回收NgRBP基因的PCR产物与0.5 μL的PMD-18T克隆载体在16℃水浴锅过夜连接，转化大肠杆菌感受态细胞DHB4，在LB (Amp+) 固体培养基上37℃培养12-14 h后，挑取白色单菌落，进行菌落PCR鉴定。

所得阳性克隆提取质粒，用限制性内切酶Bam HI和Sac I双酶切重组质粒2-3 h，对酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，得到两条带，一条约2.7 kb的是PMD-18T 载体，另一条是471 bp的目的条带（图1B），说明NgRBP基因与PMD-18T载体连接成功并转化大肠杆菌。

挑取酶切鉴定完毕的阳性克隆菌液送往上海生工测序，序列比对说明克隆所得NgRBP基因的序列和原序列完全相同。

1.3 表达载体的构建
凝胶回收NgRBP基因的酶切片段，同时用相应的限制性内切酶酶切pBI121空载体的质粒，并回收酶切后的载体片段，用T4连接酶连接目的片段和载体片段12 h，然后用热激法转化转化大肠杆菌感受态细胞DHB4，在LB (K+) 固体培养基上37℃培养12-14 h后，挑取白色单菌落，进行菌落PCR和双酶切鉴定（图
1C），结果表明已成功获得重组质粒pBI121-NgRBP。

用冻融法将重组质粒转化根癌农杆菌GV3101，菌液PCR鉴定筛选阳性克隆。

图1 基因克隆与重组质粒的酶切鉴定
NgRBP基因克隆(A)、PMD-NgRBP酶切鉴定(B)、pBI121-NgRBP酶切鉴定(C)、TRV-NgRBP酶切鉴定(D)、PVX-NgRBP酶切鉴定(E)、PET30a-NgRBP酶切鉴定(F)和pROKII-NgRBP-GFP酶切鉴定(G)。

1.4表达NgRBP基因的TRV和PVX病毒载体的构建
以提取的PMD-NgRBP质粒为模板，用根据TRV和PVX病毒载体酶切位点分别设计相应的特异性引物进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳均可见471 bp 的扩增条带，与理论大小相符。

回收目的片段，连接PMD-18T载体，转化大肠
杆菌感受态DHB4。

重组质粒分别用限制性内切酶Bam HI/Sac I和Cla I/Not I酶切鉴定并回收目的片段。

同时用限制性内切酶Bam HI/Sac I和Cla I/Not I分别酶切TRV和PVX空载体，凝胶电泳回收载体片段。

用T4连接酶在16℃水浴锅过夜连接目的片段和载体片段12 h，并转化大肠杆菌感受态DHB4。

菌落PCR筛选阳性克隆，并提取质粒，分别用限制性内切酶Bam HI/Sac I和Cla I/Not I双酶切鉴定重组质粒（图1D-E），结果证明NgRBP基因已成功连接到PVX和TRV病毒表达载体上。

试剂盒法提取质粒转农杆菌GV3101，菌落PCR鉴定阳性克隆并保存菌液。

1.5 NgRBP蛋白原核表达载体的构建
将PMD-NgRBP质粒用限制性内切酶Bam HI和Sac I消化，再用相同的内切酶酶切pET30a(+)空载体，凝胶回收目的条带和载体条带，用T4 DNA连接酶于16℃水浴锅过夜连接，然后转化大肠杆菌感受态DHB4，菌液PCR及酶切鉴定阳性克隆（图1F）。

提取重组质粒pET30a-NgRBP转化原核表达菌株BL21。

1.6 NgRBP与GFP蛋白的融合表达载体的构建
为分析NgRBP在细胞中的定位，我们将NgRBP基因与GFP基因融合共同构建到植物表达载体pROKII上，载体构建时是将NgRBP基因的终止密码子缺失并构建到GFP基因的上游。

以本实验室保存的pMD-NgRBP和pMD-GFP质粒为模板，经PCR扩增后获得NgRBP和GFP片段，回收并将其连接到pMD18-T 载体上，转化大肠杆菌DHB4，菌落PCR筛选阳性克隆，分别用限制性内切酶Bam HI/Kpn I和Kpn I/Sac I双酶切重组质粒，并回收酶切目的片段。

同时，我们先用Bam HI/Kpn I双酶切本实验室保存的表达载体pROKII的质
粒，将胶回收所获得的载体片段和酶切回收的NgRBP基因片段用T4连接酶过夜连接，转化大肠杆菌DHB4感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性克隆。

然后用限制性内切酶Kpn I/Sac I双酶切重组质粒pROKII-NgRBP，并回收载体片段。

再用T4连接酶过夜连接GFP基因片段和载体片段，并转化大肠杆菌DHB4感受态细胞，用NgRBP基因的上游引物和GFP基因的下游引物做菌落PCR鉴定筛选阳性克隆。

将构建好的pROKII-NgRBP-GFP重组质粒经限制性内切酶Bam HI/Sac I 酶切鉴定得1280 bp大小的条带（图1G），与理论大小一致。

提取质粒转化到农杆菌GV3101，PCR鉴定获得阳性克隆并保存菌液。

2.心叶烟NgRBP基因的表达模式分析
心叶烟NgRBP基因编码一个富含甘氨酸的RNA结合蛋白，其N端含有一个保守的RNA识别序列(RRM)结构域，C端包含一个富含甘氨酸结构域(GD)（图2A）。

我们还利用MEGA软件建立了NgRBP和其同源蛋白的进化树，结果表明NgRBP和普通烟的NtGRP1蛋白亲缘关系最近（图2B），氨基酸的同源性达到97%。

为分析其NgRBP基因的表达模式，我们采用反向PCR技术得到NgRBP基因启动子区域982 bp的序列（图3）。

利用PlantCARE对序列进行分析表明，NgRBP基因的启动子区域含有1个ABA响应顺势作用元件和1个MeJA响应顺势作用元件和2个光响应顺势作用元件（图3）。

Northern blot验证表明，叶面喷施ABA后，NgRBP mRNA的表达量在8 h达到峰值，从12 h表达量逐渐下降（图4A）。

而在喷施MeJA的4-24 h期间，NgRBP mRNA的表达量呈现逐渐上升的趋势（图4A）。

另外，我们检测了NgRBP基因在心叶烟的组织特异性表达。

结果表明，NgRBP基因在根、茎、叶、花均有表达，但在根和茎的表达量远高于叶和花的表达量（图4B）。

图2NgRBP蛋白结构及其与同源蛋白的进化树分析
(A)心叶烟NgRBP、普通烟NtGRP1与番茄SlGRP1蛋白氨基酸序列比对。

阴影部分表示为氨基酸的同源区域。

(B) NgRBP和来自不同物种的同源蛋白进化树分析。

建树采用邻近法，计算重复1000次。

ACTGGCACGAACTTTGATTTGAACTCGTACTCCTTGAACCTTGATTTGTTCTTCGTTCTTAA AATTGAACTTGATTTCTTGAACTTGAACTTGATTGCTTGAAGCTTGAAACTTGTAGAGAAAA TTGCGGCGTTCGATCCACGAGCTCTCTCTTGCTTCTTGTTATAACTTCTGGTCCTTTTTCTGG GTTATGAAGACCCCTATTTATAGTTGTGGAAGGGAGGAGTTGTGATAAGAATGAACTCTTTC CGACCAATCAAATTGAAGTGTGACATGGCCGCATTTGATTGGCCAGAACA TGTCACTTGCA CACGTGGCGCGATTTCATTGGCCTTTTAATGTGACTTGACACGCTTTGTCA TTTTGACATGTG TCATGATCCCATTGGCTCTTCTGTTTGACTAGGCGTGCCACGTCATTTGACACGTGGGCA TC
CATTTGGGCCTCTAGGAAGATGAAATCTTGGGCCTAATGAATTTGGCTCA TCACTTTAGCCC CACCAAATGGGCTAGCCCAATGGATTAAGACTTATTTATTTAA TCCATA TA TATTGGACTTA TA TAATTAATTCAATTATATTAGCCCGTAATATTTATTTGGACTAATATAACTTGAA TTTAAAATA T
AATCCAACTTATTTTATGAATTTAATTTTAATAAAATTTA TATCTACAGTA TTA TTCTAACTTGG ACTGAATATGAATTATTTGTGCGCCTGGAACAAGTTGAAGAAAGTGACAAAAATACACGAG AGACGGAGTTTTCTCAGTAACCAAACGGACAAATATTTTTTAACCAGA TA TCTAAACCCGAG TTGCATTGAAGTTAGGAAAAGAACCGCCGTGCACGATTAACTTAACCAGCCCTACACCCAA ACCTAGGCTCCTCAACCAGCCTATAAAACCGGCGTTTTCTACCCTCCTCTCCACAGCTA TCT CTCACTTTGTTTTTAGGGTTTTTTTATTAATCAGAAAAA atg
图3 NgRBP 基因部分启动子序列及顺势作用元件预测
下划线表示预测的顺势作用元件的序列。

ABRE ，响应ABA 的顺势作用元件；MeJA ，响应MeJA 的顺势作用元件；Skn-1_motif, 胚乳表达必需顺势作用元件；G-box 、Box-4, 光响应顺势作用元件。

CGTCA-motif G-Box
Box4
ABRE Skn-1 motif
图4 心叶烟NgRBP基因表达模式分析
(A)心叶烟植株叶片喷施ABA (1 mM) 和MeJA (100 µM) 后，不同时间点的NgRBP基因响应ABA和MeJA的表达模式分析。

(B) 心叶烟NgRBP基因在根、茎、花、叶表达量分析。

总RNA的上样量为10 µg。

EB染色的28S rRNA作为mRNA上样量控制。

2.NgRBP蛋白定位于细胞质
蛋白的功能通常和它在细胞内的定位密切相关。

为研究NgRBP蛋白在细胞内的定位，我们构建了NgRBP和GFP蛋白的融合表达载体（图5A）。

利用农杆菌介导的瞬时表达系统，我们将35S-GFP和35S-NgRBP-GFP分别侵染本生烟。

侵染后第3天，取侵染区的表皮细胞在激光共聚焦显微镜下观察。

在40X物镜的扫描下，我们发现侵染35S-NgRBP-GFP的叶片细胞内的绿色荧光主要分布在细胞质中，细胞核内没有发现有绿色荧光（图5B）。

为进一步确定上述结果，我们换20X 物镜观察表明绿色荧光仍主要分布在细胞质内，而侵染35S-GFP叶片细胞内的绿色荧光在细胞核和细胞质都有分布（图5B）。

图5 NgRBP蛋白亚细胞定位分析
(A)NgRBP和GFP融合蛋白载体构建示意图。

(B)侵染35S-GFP和35S-NgRBP-GFP本生烟叶片细胞内的荧光分布。

4.NgRBP沉默抑制功能分析
4.1NgRBP抑制由单链RNA引发的局部和系统RNA沉默
为了分析NgRBP的沉默抑制能力及特点，我们将35S-GFP分别与空载体、35S-NgRBP、35S-p19共侵染转GFP的本生烟16c。

在紫外光和激光共聚焦显微镜观察发现，在侵染后第3天，35S-GFP与空载体的共侵染叶片表现微弱的绿色
荧光，到第6天后侵染区完全变红，绿色荧光丢失表明GFP基因被沉默了；然
而，35S-GFP分别与35S-NgRBP、35S-p19共侵染的区域仍呈现较强的绿色荧光（图6A）。

我们还发现35S-GFP与35S-NgRBP共侵染区绿色荧光的强度在第6天较第3天强，但强度在两个阶段均明显弱于35S-GFP与35S-p19的共侵染区（图6A）。

图6 NgRBP抑制单链GFP引发的局部和系统性沉默
(A) 35S-GFP分别与空载体、35S-NgRBP、35S-p19共侵染转GFP本生烟16c株系，侵染后第3天和第6天在长紫外灯下和激光共聚焦显微镜下观察现象。

(B)对上述侵染区GFP mRNA和siRNA进行Northern blot检测。

EB染色的28S rRNA与tRNA分别作为mRNA和siRNA的上样量控制。

(C) 35S-GFP分别与空载体、35S-NgRBP、35S-p19共侵染转GFP本生烟16c株系，侵染后第12天在长紫外灯下观察现象。

(D) 对上述侵染植株上部新生叶片的GFP mRNA进行Northern blot检测。

EB染色的28S rRNA作为mRNA的上样量控制。

为了从分子水平上验证以上的绿色荧光观察结果，我们对上述侵染区的叶片材料在亲然后第3天和6天取样，提取总RNA后用地高辛标记的GFP探针进行Northern blot检测。

结果与我们观察到的现象一致，35S-GFP分别与35S-NgRBP、35S-p19的侵染区在第3、6天均有大量的GFP mRNA积累；而35S-GFP与空载体的侵染区在第3天有较低水平的GFP mRNA积累，在第6天，其积累水平几乎检测不到（图6B）。

siRNAs的形成是侵染区发生RNA沉默的一个标志，对上述各侵染区的GFP siRNA进行Northern blot 分析表明，35S-GFP与空载体在侵染后第3天有微量的GFP siRNA积累，到第6天后，其积累水平更高；而35S-GFP分别于35S-NgRBP、35S-p19的共侵染区在第3、6天均没有检测到GFP siRNA的积累（图6B）。

RNA沉默的信号能从局部侵染区运输到其他位置，进而引发系统性的RNA 沉默。

为了检测NgRBP能否抑制单链GFP引发的系统性的RNA沉默，我们在紫外灯下监测各被侵染植株新生叶片发生系统性沉默的情况。

结果表明，在侵染后第12天，35S-GFP与空载体共侵染的植株上部的新生叶片沿叶脉变成了红色，发生了典型的系统性GFP基因沉默；而35S-GFP分别与35S-NgRBP、35S-p19共侵染植株上部的新生叶片仍然保持绿色荧光，说明没有发生系统性沉默（图6C）。

为了进一步上述结果，我们检测了侵染后第12天各侵染植株上部新生叶片GFP mRNA 的积累水平。

结果表明，35S-GFP与空载体共侵染植株上部新生叶片的GFP mRNA积累量明显低于35S-GFP与35S-NgRBP、35S-p19共侵染植株上部的新生叶片的GFP mRNA积累量（图6D）。

以上结果表明，NgRBP是一个内源性的沉默抑制子，能抑制单链GFP RNA引发的局部和系统性RNA沉默。

4.2利用PVX病毒载体验证NgRBP的沉默抑制功能
为了进一步验证NgRBP具有RNA沉默抑制的功能，我们分别用PVX和PVX-NgRBP侵染野生型本生烟，侵染PVX的植株作为实验对照（图7A）。

观察发现，在侵染后第10天，本生烟上部的新生叶片上部分呈现萎黄、坏死、花叶等典型的PVX病毒症状，并且侵染PVX-NgRBP本生烟植株的发病程度要重于侵染PVX空载体的植株（图7B）。

我们采用Northern blot 对上述现象进行验证，结果表明，侵染PVX-NgRBP植株中病毒RNA的积累量高于侵染PVX的（图7C），表明NgRBP具有抑制沉默的功能，促进了PVX病毒在本生烟上部新生叶片中的传播。

图7 NgRBP增强PVX病毒在本生烟的侵染
(A)表达NgRBP的PVX载体构建示意图。

(B PVX与PVX-NgRBP分别侵染本生烟10天后发病情况照片采集。

Mock 植株接种缓冲液。

(C)对PVX或PVX-NgRBP侵染本生烟植株的PVX病毒RNA积累量进行进行Northern blot检测。

EB染色的28S rRNA作为mRNA 上样量控制。

4.3NgRBP抑制双链RNA引发的局部和系统RNA沉默
反向重复序列（dsRNA）能产生更高水平的siRNAs，进而引发更强烈的RNA 沉默。

为了探究NgRBP能否具有抑制双链GFP RNA引发的RNA沉默，我们用35S-GFP，35S-dsGFP分别与空载体、35S-NgRBP、35S-p19共侵染转GFP本生烟16c。

在侵染后的第3天，35S-GFP，35S-dsGFP与空载体共侵染植株的侵染区几乎完全看不到绿色荧光；然而，在侵染后的第3和6天，35S-GFP，35S-dsGFP 分别与35S-NgRBP、35S-p19共侵染的叶片侵染区都有较强的GFP绿色荧光表达（图8A）。

用Northern blot验证表明，在侵染后的第3天和第6天，35S-GFP，35S-dsGFP 与35S-NgRBP或35S-p19的共侵染区比35S-GFP，35S-dsGFP与空载体侵染区的GFP mRNA积累水平高很多（图8B）。

对GFP siRNA的分析表明，35S-GFP，35S-dsGFP与空载体共侵染区在侵染后第3天就有GFP siRNA的积累，在第6天积累量更高；然而，在35S-GFP，35S-dsGFP与35S-NgRBP或35S-p19的共侵染区几乎检测不到GFP siRNA的积累（图8B）。

为了探讨NgRBP能否抑制双链GFP引发的系统性的RNA沉默，我们用35S-GFP，35S-dsGFP分别与空载体、35S-NgRBP或35S-p19共侵染转GFP本生烟16c。

在侵染后第12天，35S-GFP，35S-dsGFP与空载体共侵染的植株上部的
新生叶片发生了典型的系统性沉默；而35S-GFP，35S-dsGFP分别与35S-NgRBP 或35S-p19共侵染植株上部的新生叶片仍然保持绿色荧光（图8C）。

对新生叶片的GFP mRNA的检测表明，35S-GFP，35S-dsGFP与35S-NgRBP或35S-p19共侵染植株上部的新生叶片有较高水平的GFP mRNA积累量；而35S-GFP，35S-dsGFP与空载体共侵染植株上部的新生叶片几乎检测不到GFP mRNA的积累，这与我们的观察结果一致（图8D）。

综上所述，NgRBP能抑制双链GFP 引发的局部和系统性RNA沉默。

图8 NgRBP抑制双链GFP引发的局部和系统性沉默
(A) 35S-GFP，35S-dsGFP分别与空载体、35S-NgRBP、35S-p19共侵染转GFP本生烟16c株系，侵染后第3天和第6天在长紫外灯下和激光共聚焦显微镜下观察现象。

(B)对上述侵染区GFP mRNA和siRNA进行Northern blot检测。

EB染色的28S rRNA与tRNA分别作为mRNA和siRNA的上样量控制。

(C) 35S-GFP，35S-dsGFP分别与空载体、35S-NgRBP、35S-p19共侵染转GFP本生烟16c株系，侵染后第12天在长紫外灯下观察现象。

(D) 对上
述侵染植株上部的新生叶片的GFP mRNA进行Northern blot检测。

EB染色的28S rRNA作为mRNA上样量控制。

5.心叶烟NgRBP沉默植株提高对PVX和CMV的抗性
为了进一步研究NgRBP基因在病毒防御反应中的作用，我们利用TRV载体介导的病毒诱导的基因沉默体系下调NgRBP基因的表达量。

RT-PCR检测表明，在接种TRV：NgRBP 15天后，心叶烟植株上部新生叶片NgRBP的表达量下调到了接种TRV：00的30%（图9A），表明TRV病毒载体介导的基因沉默体系在心叶烟中能够有效抑制内源基因的表达。

我们在NgRBP系统性沉默植株和空载体植株分别接种PVX和CMV两种病毒。

接种10天后，沉默植株和空载体植株均出现明显的病毒症状，然而，我们发现NgRBP沉默植株的发病症状要轻于接种空载体的植株，在其上部的新生叶片上只表现出轻微的花叶和萎黄（图9B）。

死亡的植物细胞内由于酚类物质的大量积聚，在紫外光的照射下会产生自发荧光。

根据这个原理，我们发现NgRBP 沉默植株因病毒侵染而引发的死亡细胞少于接种空载体植株的（图9B）。

我们进一步的用台盼蓝染色发病的叶片，也同样表明沉默植株的死亡细胞数量少于空载体植株（图9C）。

用Northern blot检测了两种病毒RNA的含量，结果表明，在接种的第10天，NgRBP沉默植株的PVX和CMV的病毒RNA的积累量微低于空载体植株（图9D）。

综上所述，NgRBP基因负调控于心叶烟的抗病毒反应，其沉默之后减弱了病毒在心叶烟的侵染能力。

图9心叶烟NgRBP沉默植株提高对PVX和CMV的病毒抗性
(A)对心叶烟植株侵染TRV：00或TRV：NgRBP 15天后NgRBP mRNA表达量进行RT-PCR检测。

(B)对上述植株分别接种PVX或CMV病毒10天后，发病症状照片采集。

(C)对上述发病植株典型叶片台盼蓝染色结果的体式显微镜观察(Bar=800 µm)。

(D) 对上述发病植株的PVX或CMV的病毒RNA积累量进行Northern blot检测。

EB染色的28S rRNA作为mRNA上样量控制。

6.NgRBP蛋白不结合siRNA
沉默抑制子抑制沉默的一个经典策略就是结合siRNA，阻止RISC复合物的形成。

NgRBP作为一个RNA结合蛋白，有可能通过这种方式去抑制沉默。

为验证上述可能性，我们采用凝胶阻滞迁移技术(EMSA)检测了NgRBP和siRNA亲
和力。

首先，我们根据GFP基因的序列设计了两条碱基互补，且3撇端突出两
个碱基，长度为21个核苷酸的siRNA序列。

用T4 RNA连接酶对其3撇端进行生物素标记，退火后得到双链siRNA。

然后，我们通过原核蛋白表达系统于18℃，经IPTG (终浓度为0.5 mM)诱导12 h，镍柱纯化目的蛋白，并用透析袋浓缩洗脱后蛋白。

SDS-PAGE电泳检测和Bradford法蛋白浓度测定表明，所得蛋白在纯度和浓度均达到EMSA的实验要求（图10A）。

试验中，5个不同浓度的NgRBP 蛋白分别和siRNAs在25℃下孵育30分种，然后通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离复合物，经转膜、显影来检测NgRBP蛋白和siRNA的亲和力。

结果表明，在15 μL体系中，NgRBP蛋白的摩尔浓度从390 nM到2600 nM均不结合siRNA （图10B）。

而作为阳性对照的NS1蛋白对siRNA表现出很强的亲和力（图10B）。

图10NgRBP蛋白和siRNAs的亲和力分析
(A)NgRBP蛋白表达和纯化及SDS-PAGE电泳检测。

M，蛋白分子量标准；1，空载体PET30a (BL21)诱导表达(0.5mM)；2，PET30a-NgRBP (BL21)诱导表达(0.5mM)。

(B)梯度递增的NgRBP蛋白(390nM-2600nM)与siRNA(2.5nM)亲和力native-PAGE电泳后，经转膜、检测、曝光显影。

流感病毒编码的NS1蛋白作为实验的阳性对照。

7. 异源表达NgRBP拟南芥中降低miRNAs与DCL1 mRNA的表达量
图11异源表达NgRBP在拟南芥中降低了miRNAs与DCL1 mRNA的表达量。

(A)转NgRBP基因拟南芥和野生型(Col-0)的表型分析。

(B) RT-qPCR检测转基因拟南芥两个株系的NgRBP mRNA表达量。

(C) RT-qPCR检测转基因和野生型拟南芥中miRNAs表达量。

(D) RT-qPCR检测检测转基因和野生型拟南芥中DCL1和AGO1 mRNA表达量。

野生型植株作为对照，表达量设为1.0，试验中选取U6或AtActin1作为内参基因。

显著性分析采用双侧t检验(*P≤0.05, **P≤0.01, ***P≤0.001)。

内源性沉默抑制子的作用机制和miRNA途径有着密切的关系。

为了研究NgRBP蛋白是否干扰miRNA途径，我们构建了转NgRBP基因拟南芥。

表型分析发现，相对于野生型Col-0，转基因拟南芥植株矮小并且花期推迟（图11A）。

我们用qRT-PCR检测了转基因拟南芥两个株系的表达量（图11B），在后续的试验中，我们选用了表达量较高的#6株系。

我们用qRT-PCR检测拟南芥8个miRNAs的表达量，包括miRNA156、miRNA159、miRNA160、miRNA162、miRNA164、miRNA167、miRNA171 和miRNA390。

结果表明，转基因植株中miRNA的表达量均低于野生型。

其中6个被检测的miRNAs：miRNA160、miRNA162、miRNA164、miRNA167、miRNA171、miRNA156已达到显著性差异（图11C）。

最值得我们注意的是miR162的表达量相对于野生型植株低了4倍，差异达到了极显著水平（图11C）。

为了解释这一现象，我们还检测了参与miRNA合成两个关键基因的表达量。

结果表明，AGO1的表达量在野生型和转基因拟南芥中没有显著性差异，然而，转基因拟南芥中DCL1的表达量极显著的低于野生型的（图11D）。

推测可能是NgRBP 蛋白抑制了DCL1的表达量，导致miRNAs前体不能高效剪切为成熟的miRNAs。