国家自然科学基金项目申请书范文【医学领域】

（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）：
1．项目的立项依据
细胞增殖和凋亡(apoptosis)调节失控与肿瘤的发生发展密切相关，以促进肿瘤细胞凋亡为策略的肿瘤生物治疗倍受国内外学者的重视。

1997年Ambrosini等发现survivin基因是一种独特的凋亡抑制基因，表达于几乎所有人类的肿瘤组织，但在分化的正常组织中沉默[1-3]。

Survivin 的表达可显著抑制肿瘤细胞凋亡[4]。

由于survivin在肿瘤细胞高表达及促进细胞增殖和抗凋亡的双重作用，设计以survivin为靶点，使其沉默进行抗肿瘤治疗，可促进肿瘤细胞凋亡，同时抑制肿瘤细胞浸润并增强其对放化疗的敏感性。

最近，国外学者及本实验室采用基因阻遏技术如反义技术等抑制survivin的表达，可直接促进白血病细胞及部分实体肿瘤细胞凋亡[5，6]。

而肿瘤细胞的彻底清除最终有赖于机体的特异性免疫应答，由于大多数肿瘤抗原以及凋亡的肿瘤细胞免疫原性较弱，不能诱导机体产生有效的抗肿瘤免疫应答。

故抑制肿瘤细胞增殖与促进肿瘤细胞凋亡的治疗策略均难以彻底清除机体内的肿瘤细胞。

因此，在抑制肿瘤细胞增殖与诱导肿瘤细胞凋亡的同时，如何增强其免疫原性，诱导机体对肿瘤的特异性免疫应答，达到彻底清除残留肿瘤细胞或微小转移病灶是值得探索的课题。

热休克蛋白（HSP）作为分子伴侣与正常的组织细胞肽形成的复合物不引起免疫应答，但可结合各种突变了的肿瘤抗原肽，且能够将其有效的进行提呈，诱导CD8+CTL、CD4+T细胞以及NK细胞反应，杀伤肿瘤细胞[16，17，18]。

最新研究证明，机体可通过非自我天然识别机制（innate recognition of non-self）如补体、CD14等清除凋亡细胞[7]，或通过改变了的自我吞噬识别机制(phagocyte recognition of altered-self)如巨噬细胞表面受体CD36和氧化低密度脂蛋白受体吞噬清除凋亡细胞[8]，或通过非分离自我吞噬识别机制(phagocyte recognition of non-detaching self)如ICAM3的相互作用吞噬清除凋亡细胞[9]，由此可能诱导反应性T细胞无能而致免疫耐受[10-12]，如以凋亡的肿瘤细胞冲击DC细胞则能激活肿瘤特异性CD8+T细胞，但凋亡的肿瘤细胞冲击巨噬细胞无此功能[13]。

因此，能否通过HSP有效地增强凋亡肿瘤细胞的免疫原性，主动地诱导特异性T细胞免疫应答，从而增强机体对残存肿瘤或微小转移病灶的杀伤效应，以及探讨其机制具有重大的理论与实际意义。

本研究在原有特异性靶向基因、Survivin反义RNA以及HSP-肿瘤抗原肽复合物抗肿瘤实验研究的基础上，拟构建转铁蛋白受体（TFR）单链抗体-GAL4（TFR-ScFv-GAL4）靶向的pU-Survivin-siRNA /pCMV-HSP-GFP双基因表达载体，通过鼠U6启动子调控siRNA的转录，由siRNA（干扰性短小RNA）中的反义链指导形成沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC），由RISC介导切割Survivin mRNA分子中与反义链互补的区域，从而干扰Survivin的转录和翻译，促进肿瘤细胞凋亡；另一方面，凋亡的肿瘤细胞作为抗原提呈细胞(APC)或肿瘤抗原肽，通过CMV启动子调控表达的HSP作为分子伴侣，与凋亡细胞内一系列抗原肽形成复合物，或通过不同机制溶解的凋亡细胞肿瘤肽与HSP形成复合物，且大多数专职APC细胞表面表达HSP受体,如CD91，可与HSP肽复合物结合，从而通过内源性的或/和外源性的抗原提呈途径有效地诱导机体对肿瘤的特异性免疫应答；并以GFP作为标记分子，探讨HSP作为分子伴侣的抗原提呈过程；拟通过T细胞克隆技术和荷瘤动物实验探讨其抗瘤效应及其机制。

本课题设想：根据肿瘤细胞高表达survivin为理论基础，将其作为促进肿瘤细胞凋亡的作用靶点。

利用肿瘤细胞表面高表达CD71的特点，将其抗体作为靶向分子，拟通过转染双基因抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的同时，以凋亡的肿瘤细胞为APC或抗原肽、HSP作为
分子伴侣，诱导机体的特异性抗肿瘤免疫应答、最终达到彻底清除肿瘤细胞的目的，并探讨HSP 的抗原提呈过程，其设计新颖，将为肿瘤的基因免疫治疗开辟新的途径，且可为寻找肿瘤特异
性抗原提供新的思路。

2．项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。

研究目标：
1.建立TFR-ScFv-GAL4靶向的GAL4rec-pCMV-HSP-GFP-IRES- pU-siRNA表达载
体，分别通过鼠U6启动子和CMV调控siRNA的转录和HSP-GFP的表达；
2.以肝癌为靶细胞，通过TFR-ScFv-GAL4靶向转移的Survivin-siRNA诱导肝癌细
胞凋亡；
3.体内外通过TFR-ScFv-GAL4靶向转移的GAL4rec-pCMV-HSP-GFP-IRES-
pU-siRNA表达载体，促进肝癌细胞凋亡的同时，主动地诱导针对转染和未转染基因的肝癌细胞的特异性免疫效应，为如何通过诱导肿瘤细胞凋亡和特异性免疫应答双重效应，发挥针对肿瘤细胞特异性的免疫效应，达到彻底清除残留肿瘤细胞或微小转移病灶，为肿瘤的基因免疫生物治疗开辟新的途径，并为寻找肿瘤特异性抗原提供新的思路；
4.以GFP作为标记分子，通过多光子共聚焦显微镜动态观察HSP的抗原提呈过程，
揭示HSP作为分子伴侣的细胞内转运过程及细胞外与APC结合的特征。

研究内容：
1. 构建TFR-ScFv-GAL4靶向转移的HSP-GFP/siRNA真核表达载体
GAL4rec-pCMV-HSP-GFP-IRES- pU-siRNA。

2. 体外转染GAL4rec-pCMV-HSP-GFP-IRES- pU-siRNA的肝癌细胞株凋亡的研究。

3.体外转染GAL4rec-pCMV-HSP-GFP-IRES-pU-siRNA的肝癌细胞株诱导针对肝
癌细胞株的特异性T细胞的免疫效应及其机制。

4.特异性T细胞克隆的诱导：体外转染GAL4rec-pCMV-HSP-GFP-IRES- pU-siRNA
的肝癌细胞株诱导特异性T细胞克隆，对转染和未转染双基因的肝癌细胞株的免疫效应。

5.建立采用多光子共聚焦显微术观察HSP提呈内源性抗原和外源性抗原过程的方
法：包括观察凋亡细胞内HSP-肽复合物抗原提呈过程及APC摄取的肿瘤抗原肽HSP复合物抗原提呈过程。

6．诱导细胞凋亡与特异性免疫应答双重效应的体内实验研究，建立动物模型，观察置入转染GAL4rec-pU-siRNA-IRES-pCMV-HSP-GFP的肝癌细胞的荷瘤动物生
存时间、诱导免疫应答以及对再次置入的肝癌细胞株的特异性免疫应答效应。

6.拟解决的关键问题：
7.靶向转移的真核表达载体系统的建立，通过转染基因增强凋亡肿瘤细胞的免疫原
性，并通过体外细胞培养技术获得特异性T细胞克隆，建立采用多光子共聚焦显微术观察HSP提呈内源性抗原和外源性抗原过程的方法，以及成功建立动物模型等是本课题顺利进行的前提。

8.2．揭示在诱导肿瘤细胞发生凋亡的同时，主动地诱导针对肿瘤细胞有效的特异
性免疫应答，从而彻底清除机体内的瘤细胞，，为肿瘤的基因免疫生物治疗开辟新的途径，是本课题拟解决的关键问题和最终目的。

3．拟采取的研究方案及可行性分析
拟采取的研究方案
(1) 真核表达载体系统的建立：含CMV和U6双启动子的siRNA与HSP-GFP真核表达
载体系统GAL4rec-pCMV-HSP-GFP-IRES- pU-siRNA的构建
1) 采用T7 RNA连接酶合成与survivin特异性结合的siRNA，引入酶切位点；
2) 将已扩增的HSP70-GFP和合成的siRNA分别克隆到含CMV和U6双启动子的IRES
的表达载体GAL4rec-pEGFP-N1，构建含HSP70-GFP和siRNA的GAL4rec-pCMV-HSP-GFP -IRES- pU-siRNA真核表达载体，转染大肠杆菌，筛选阳性克隆，经菌落PCR及酶切鉴定。

(2) 靶向转移的真核表达载体系统的建立与转染：将已构建的靶向转移系统
TFR-ScFv-GAL4与真核表达载体系统GAL4rec-pCMV-HSP-GFP-IRES-pU-siRNA 在体外混合，制备成靶向转移的真核表达载体系统TFR-ScFv-GAL4- GAL4rec-pCMV-HSP-GFP-IRES-pU-siRNA复合物，转染肝癌细胞株，采用RT-PCR、ELISA、共聚焦显微镜等技术从基因及蛋白质水平检测其表达。

(3) GAL4rec-pCMV-HSP-GFP-IRES-pU-siRNA转染的肝癌细胞株凋亡的检测：
采用Annexin V 染色，FACS 、共聚焦显微术等技术检测转染目的基因的肝癌细胞和未转染肝癌细胞的凋亡；
(4) 体外转染GAL4rec-pCMV-HSP-GFP-IRES-pU-siRNA的肝癌细胞株诱导特异性T 细胞免疫效应的检测：
1）采用3H标法、FACS检测转染基因的肝癌细胞诱导特异性T细胞的增殖反应；
2）采用免疫学方法及生物学活性方法检测特异性T细胞细胞因子的分泌水平，如IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-12等；
(5) 特异性T细胞克隆的诱导与效应检测：
1）通过转染目的基因的肝癌细胞体内免疫动物，取其淋巴结细胞与相应的肝癌细胞共同培养，加入IL-2，诱导特异性针对肝癌细胞的特异性T细胞克隆，并通过细胞表面标志及其功能鉴定特异性T细胞克隆；
2）采用51Cr释放试验及流式细胞术检测特异性T细胞克隆对转染及未转染目的基因的肝癌细胞株细胞毒效应。

（6）HSP抗原呈递过程的观察：
1）转染目的基因细胞与特异性T细胞克隆共培养，以HSP-GFP融合蛋白中GFP 作为标记分子，采用多光子共聚焦显微镜观察凋亡细胞内抗原肽-HSP复合物的
转运、细胞表面表达过程；
2）转染目的基因细胞与APC及特异性T细胞克隆共培养，以HSP-GFP融合蛋白中GFP作为标记分子，采用多光子共聚焦显微镜观察APC对凋亡细胞或抗原肽
-HSP-GFP复合物的摄取、转运过程。

（7）体内研究：
1)以小鼠作为动物模型，将转染目的基因的小鼠肝癌细胞注射到鼠体内，观察其对转
基因细胞、未转基因细胞的抗瘤效应，包括肿瘤大小、有无转移以及动物存活时间；
2) 取实验动物的脾细胞，与转染目的基因和未转染目的基因的肝癌细胞株混合培养，
采用凋亡检测试剂盒检测肝癌细胞株的凋亡；采用3H标法、FACS检测T细胞增殖。

可行性分析
1、本课题组研究已证明：通过反义RNA技术抑制Survivin的表达可促进肿瘤细
胞凋亡并增加其对化疗药物的敏感性，HSP70结合肿瘤抗原肽可增强机体特
异性的免疫应答，为本课题研究奠定了坚实的理论基础；本课题设计拟构建
的表达载体中pCMP启动子和pU6启动子可分别调控HSP-GFP的表达及
SiRNA的转录，可分别实现从蛋白质水平和基因水平发挥效应。

因此本课题
通过转染目的基因促进肿瘤细胞凋亡的同时诱导特异性免疫效应，并观察
HSP的抗原提呈过程，设计可行；
2、本课题组采用多光子共聚焦显微镜已动态观察细胞凋亡过程，本课题拟利用
多光子共聚焦显微镜的高空分辨率特点，能对笼锁化合物实现定点解笼锁，
以GFP作为标记分子，能实现对HSP-GFP融合蛋白在细胞内精确空间分布、
转运及动力学观察，以及与细胞表面受体的结合与胞吞过程。

多光子共聚焦
显微镜的光漂白小、对活细胞无损伤等优势，使长时间动态观察HSP的抗原
提呈过程成为可能并可记录成像。

3、课题组十多年来已承担抗肿瘤免疫课题多项，并顺利完成。

本课题所采用的
现代分子生物学技术、细胞生物学技术、免疫学技术、生物光学技术以及动
物模型的制备方案本实验室均已具备，已构建的TFR-ScFv-GAL4转移系统
中的GAL4可识别表达载体中的GAL4rec，可特异性将表达系统靶向转染
TFR+的肿瘤细胞，故技术路线可行。

国家自然科学基金项目申请书4．本项目的特色与创新之处
5．年度研究计划及预期研究结果。