抗生素的分离与纯化

衡水学院
结课论文抗生素的分离和纯化
论文作者：邢五星
系别：生命科学系
专业：
：生物科学
学号************ 年级：2014级
抗生素的分离和纯化
抗生素是由生物包括微生物、植物、动物在其生命活动过程中产生的一类天然有机化合物,具有能在极小的浓度下有选择地抑制、促进或杀灭其他微生物和生物细胞的作用。

由于其存在于成分复杂的发酵液中,因此采用合理有效的分离纯化技术路线是新型抗生素研究成功与否的关键。

1.发酵液的预处理
微生物发酵液的预处理,其目的不仅在于分离菌体和其他悬浮颗粒,还着眼于除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质,以利于提取和精制后续各工作的顺利进行。

对于胞外产物,经预处理应尽可能使目的产物转移到液相,然后经固液分离除去固相;对于胞内产物,则首先收集菌体,经细胞破碎后,目的产物进入液相,然后再将细胞碎片分离。

改变发酵液过滤特性的方法有:调酸(等电点)、热处理、电解质处理、添加凝聚絮凝剂等。

另外通过调节发酵液的酸碱度或加入合适的溶剂也可以除去部分相应的杂质,如调节发酵液pH值过酸性或过碱性可以使大部分蛋白类杂质沉淀除去,用高浓度甲醇、乙醇或丙酮溶液浸提发酵液,既可以沉淀出大部分不溶性多糖和蛋白杂质,又可以降低发酵液粘稠度,有利于过滤、色谱分离等进一步处理。

廖文彬、鲍时翔等报道[1],采用有机溶剂乙醇B丙酮(1B1)的混合液可以很好的除去红树林放线菌发酵液中的的蛋白等杂质,有利于活性物质的分离纯化。

解翠华、夏焕章等报道[2]用草酸调节发酵液pH值至3,然后离心,可以使发酵液和菌丝体很好的分离,分别用乙酸乙酯对上清液进行萃取;对菌丝体进行抽提;都得到了具有活性的粗提物。

2.抗生素常用的分离纯化方法
抗生素常用的分离纯化方法主要有溶媒萃取法、吸附法、离子交换法、沉淀和结晶、色谱分离等。

在提取时,可根据抗生素分离的难易,单独或同时使用上述方法。

2.11 溶媒萃取法
溶媒萃取法是利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同,使溶质选择性的从一种溶剂转移到另一种溶剂中而得到纯化或浓缩的方法,它是生物工业中一种重要的分离提取方法。

作为一种传统的分离技术,溶媒萃取法目前仍然在广
泛应用于在抗生素工业生产中,如螺旋霉素、林可霉素、青霉素等都采用溶媒萃取法提取。

尽管选择性更高、分离度更好的现代分离技术和方法不断出现,但还是不能完全替代溶媒萃取法。

另外,近年来,溶媒萃取法在传统的有机溶剂萃取技术的基础上,萃取机制和方法也在不断发展完善,相继出现了各种新的现代萃取技术,其中的超临界CO2萃取技术[3]以其在天然产物分离方面的独特优势备受青睐, 20世纪80年代以来,已经在许多领域中实现了工业化。

萃取和反萃取同时进行的液膜萃取、反胶团萃取、双水相萃取等技术相继取得了重大进展[4-6]。

这些都使得萃取技术更加全面,适用于各种生物产品的分离纯化。

2.12 吸附法
吸附法是利用吸附剂与抗生素之间的分子引力而将抗生素吸附在吸附剂上。

常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、大孔吸附树脂等。

大孔吸附树脂是当前微生物天然产物分离技术领域发展最迅速、最活跃的分支之一,目前它已逐渐取代活性炭和氧化铝等吸附剂,在抗生素工业中显示出越来越重要的地位。

大孔吸附树脂适合于吸附各种抗生素,它不仅可吸附脂溶性化合物,而且可以吸附水溶性化合物。

有文献报道,近年来,国内应用大孔吸附树脂进行分离、提取、浓缩、纯化的抗生素涵盖了目前已知抗生素的所有类型[7]。

姬生宝等[8]藤黄灰链霉菌发酵液中的抗真菌活性成分SL103采用X-5型吸附树脂对活性物质进行分离纯化,对吸附饱和的X-5树脂柱用去离子水冲洗,然后用50%的甲醇洗去杂质和色素,再用50%的乙醇4mL/min的流速下进行洗脱,合并活性高的洗脱液,浓缩后静置48h得到SL103的粗结晶。

通过对结晶进行分析,实验结果表明,此结晶纯度可达95%以上;经过质谱分析,得知其为一种小分子量的抗生素,分子量为66215。

2.13 离子交换法
离子交换法是[9]利用离子交换树脂与目的物质之间的化学亲合力,有选择地将目的物质吸附上去,再用适当的洗脱剂洗脱下来。

如果目的物质为碱性,则选择酸性树脂;如果为酸性,则要选择碱性树脂。

由于抗生素是一类天然抗菌,抗病毒药物,其分子中往往含有多种化学基团,在强酸强碱条件下容易发生化学变化,导致药理活性丧失,提取分离抗生素所用的离子交换树脂主要为弱酸性阳离子交换树脂和弱碱性阴离子交换树脂。

如金霉素,丁胺卡那霉素,万古霉素,先锋霉素用弱酸性树脂;庆大霉素,新生霉素用弱减性树脂;春雷霉素,肉瘤霉素,夹竹桃霉
素用强酸性树脂;先锋霉素,土霉素用强碱性树脂。

由于抗生素分子体积较大,一般选择大孔网状树脂。

2.14 沉淀和结晶
2.141 沉淀法
沉淀法广泛用于蛋白质等大分子的提取中。

它主要起浓缩作用,纯化的效果较差,通常作为初步分离的一种方法。

沉淀法分为5种类型: 1)盐析:加入高浓度的盐使蛋白质沉淀,其机理为蛋白质分子的水化层被除去,而相互吸引。

2)加入有机溶剂:其机理为加入有机溶剂会使溶液的介电常数降低,从而使水分子的溶解能力降低,在蛋白质分子周围,不易形成水化层。

缺点是有机溶剂常会引起蛋白质失活。

3)调pH至等电点:此法沉淀能力不强,常加入有机溶剂,使沉淀完全。

4)加入非离子型聚合物:如PEG等。

5)加入聚电解质:如聚丙烯酸,其机理与盐析作用相似。

张鹏,洪葵等报道[10],通过在拮抗菌株Bacillus cereus041381发酵液上清液中加入硫酸铵,以硫酸铵饱和梯度55% -60% -65% -70%进行连续分级操作,可以将抗真菌活性蛋白有效的提取出来。

2.142 结晶
抗生素工业中常用的结晶方法有以下4种[11]。

(1)蒸发结晶。

使溶液在加压、常压或减压下加热蒸发除去一部分溶剂,以达到或维持溶液过饱和度,使晶体长大。

(2)化学反应结晶。

加入反应剂或调节pH产生新物质,当该新物质的浓度超过它的溶解度时就有结晶析出。

(3)过饱和冷却结晶。

使溶液冷却降温以维持一定过饱和度,不用除去溶剂,优点是能耗小设各构造及操作较简单,但生产速率和产率相应较低,难以自动控制。

(4)盐(溶)析结晶。

加一种物质于溶液中,以便溶质的溶解度降低形成过饱和溶液而结晶。

2.15 色谱法
色谱法是基于混合物各组分在两相(固定相和流动相)之间的不均匀分配进行分离的一种方法。

其基本原理是由于混合物中的各个单一组分对两相不同的亲和力和向两相不均匀扩散的可能性而导致在固定相和移动相之间的不均匀分配,从而得到分离。

色谱法有不同的分类根据,下面主要介绍薄层色谱、硅胶吸附柱色谱、高效液相色谱等常见色谱方法。

2.151薄层色谱(Thin LayerChromatography)
薄层色谱常用TLC表示,又称薄层层析,属于固-液吸附色谱。

是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法,它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。

一方面适用于小量样品(几到几十Lg,甚至0101Lg)的分离;另一方面若在制作薄层板时,把吸附层加厚,将样品点成一条线,则可分离多达500mg的样品。

因此又可用来精制样品。

田黎、顾振芳等[12]采用硅胶G薄板(20cm@15cm@01025cm)分离海洋细菌B-9987菌株产生的抗真菌物质,展开剂用甲苯B乙酸乙酯B90%甲酸(V/V/V)=6B3B1,得到两种活性组分。

李德顺,苏中锐等[13]真菌活性物质,采用硅胶G薄板以正丁醇B乙酸B水(V/V/V)=3B1B1为展层剂进行操作,通过生物显影技术,确定分离的为单一组分的抗生素。

21512 硅胶吸附柱色谱硅胶吸附柱色谱的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离,一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附,极性较弱的物质不易被硅胶吸附,整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。

由于硅胶既可用于非极性化合物,又可用于极性化合物的分离纯化工作,因此,在抗生素的分离纯化中硅胶柱色谱是最常用的方法之一。

陈文君、吴剑波等[14]柱层析法大量纯化农用抗生素11371A复合组分,洗脱溶剂采用甲醇:二氯甲烷(6B1)和乙醇B氢氧化铵B水(8B1B1),分段收集洗脱液,浓缩后制品最高纯度可达到85%左右。

MotooKoitabashi等[15]吸附柱,以正己烷-乙烷为流动相,体积比100B1至30B1梯度洗脱,成功的从真菌菌株Kyu-W63发酵液浓缩物中分离出两种脂溶性抗真菌组分PTF和PDF。

硅胶柱色谱因其一次性获得样品的纯度不高,虽然通过多次重复使用也可以得到更高纯度的样品,但在实际研究中更多的是作为高效液相色谱法等精制方法的前提步骤。

2.153高效液相色谱(HPLC)
20世纪60年代以后,由于柱色谱填料的改进及流动相输送和被分离物质检测技术的进步,高效液相色谱技术迅速发展起来。

它是建立在经典液体柱色谱的基础上,引入气相色谱分析的理论和技术,并加以改进而建立起来的,HPLC已成为应用最为广泛的高精度色谱技术,它对样品的适用性广,不受样品的挥发性和热稳定性限制,有分离效果好、灵敏度高、分析速度快和操作方便等优点,具适宜于各种类型抗生素分离分析中最常用的是反相高效液相色谱。

在反相高效液相色谱中,流动相的极性大于固定相的极性,通常以高极性的水与相对低极性的甲醇、
乙腈等水溶性高的有机溶剂搭配组成,通过调节水与有机溶剂的比例及流动相的流速来达到最佳分离效果。

反相色谱法适于分离非极性,极性或离子型化合物,大部分的分析任务皆由反相色谱法完成。

孙强[16]用反相色谱柱SinochromODS-BP-C1(8300mm@416mm i1d, 5Lm)对放线菌菌株MY02发酵液中的抗真菌活性物质SN06进一步纯化,以甲醇-水系统(80B20, V/V)为流动相,流动相流速为014mL/min,柱温30e,紫外检测波长304nm。

81044min和171347min两个吸收峰的收集液具有明显的活性,纯度较高,可以满足光谱分析等进一步研究的需要。

3.抗生素分离纯化实现手段
在实际的操作中,抗生素的分离纯化工作往往是通过各种分离手段相结合来完成的。

如匡岩巍,张庆林[17]从一株土壤放线菌2215的发酵提取物中分离纯化棘霉素。

其方法为:发酵液直接用有机溶剂裂解,乙酸乙酯提取,提取液浓缩至干,得到粗提物9A,C18径向加压柱分离得到11C,条件:乙睛水梯度洗脱,流速710mL/min, UV =240nm。

对11C采用制备HPLC进行分离纯化得14J,条件:C18反相柱4cm@20cm,乙睛B水为52B48, UV =240nm。

对14J进行制备薄层,氯仿/甲醇=30B1展开得到16A。

经高效液相分析,条件:KromasialC18色谱柱,甲醇B 水=7B3,UV=240。

得到活性单体,经面积归一法检测纯度达95%。

经结构鉴定其为棘霉素。

新农用抗生素[18]507的分离纯化,1)菌丝体先通过两次浸提,第1次用60%的丙酮水溶液;第2次用40%的丙酮水溶液。

2)然后用大孔吸附树脂CDA-45吸附,采用先转型再脱附的方法,即用30%的醋酸水溶液转型,再用水按012BV/min流速冲洗吸附柱至中性,再用丙酮以0103BV/min的流速洗脱,回收率98%。

然后经过多次硅胶柱层析对有效成分分离纯化,最后得到纯品。

通过各种波谱鉴定解析出了2507有效组分的分子结构,它属于一类较为少见的多肽抗生素,分子量1156,分子式为C53H67N13O13S2。

AngelaM1Hoffman等[19]株茎点霉属的植物内生真菌的代谢产物中分离纯化出三种具有抑菌活性物质,其方法为:发酵液在真空条件下过滤除去菌丝体,滤液用等体积的氯仿或二氯甲烷萃取3次,萃取液减压浓缩,无水硫酸纳干燥,然后用少量的二氯甲烷溶解得粗样品。

粗样上硅胶柱,洗脱液己烷、己烷B乙酸乙酯(99B1)、乙酸乙酯(99B2)三个洗脱梯度,经TCL跟踪检测分别分离出三种活性物质。

活性1经己烷:乙酸乙酯(1B10)重结晶
得到黄色固体,经HPLC检测为松萝酸;活性2经乙酸乙酯重结晶得到浅红色晶体, TLC比移值0154-0157,香草醛-硫酸喷后显蓝灰色。

经制备HPLC,质谱分析,确定分子量为33310683,分子式为C16H13NO7。

活性3经乙酸乙酯:甲醇(1B9)重结晶得到浅褐色晶体, TLC比移值0190-0188,香草醛-硫酸喷后显草绿色。

经制备HPLC,紫外光谱,红外光谱,拉曼光谱,质谱分析,确定分子量理论值为39011315,实验值为39011324,分子式: C20H22O8,为一种新型的天然抗菌物质。

4.结语
抗生素的分离纯化过程是一项非常繁琐艰巨的任务,尤其对未知成分的新型抗生素分析,需要投入大量的人力物力,不仅要求研究人员熟练掌握各种分离纯化技术,而且还要具有足够的耐心。

在总结前人经验的基础上,对各种分离纯化技术敢于尝试,大胆的对分离纯化技术进行创新,从而摸索出一条合理有效的分离纯化路线。

笔者认为,随着现代生物技术的飞速发展,越来越多的新型技术会应用于抗生素的分离纯化中,将会有更多的安全、无毒、高效的抗生素类药物服务于人类。

参考文献
[1]廖文彬,鲍时翔红树林放线菌产抗菌活性物质的分离纯化研究药物生物技术, 2004, 11(6): 376-380
[2]解翠华,阮丽君,夏焕章,等1植物内生菌HCCB00167产物的发酵、分离和结构鉴定沈阳药科大学学报, 2007, 24(4): 245-248
[3]李州,寥史书,雷文1制药工业中溶剂萃取的机制和应用发展方向中国医药工业杂志, 1996, 27: 89-90
[4]毛忠贵超临界流体萃取技术在生物、食品工业上的应用食品与发酵工业, 1995, (1): 66-71
[5]李十中,王淀佐抗生素提取过程中溶剂萃取技术新方法-超滤/萃取法中国抗生素杂志, 2000, 25(1): 12-15
[6]潭天伟,申忠翅双水相萃取分离技术的评价和展望微生物学通报, 1996, 23(6): 368-370
[7]黎海彬,李小梅大孔吸附树脂及其在天然产物研究中的应用广东化工,
2005(3): 22-25
[8]姬生宝,范晋勇,元英进藤黄灰链霉菌H103发酵液中抗真菌活性成分的分离纯化微生物学通报, 2005, 32(3): 77-81
[9]汪茂田,谢培山等,天然有机化合物提取分离与结构鉴定北京:学工业出版社, 2004, 8
[10]张鹏,洪葵,庄令,等抗真菌活性物质的分离纯化及生物活性研究福建热带作物科技, 2006, 31(1): 5-7
[11]邬行彦,熊宗贵,胡章助抗生素生产工艺学北京:化学工业出版社, 1991: 286
[12]田黎,顾振芳,陈杰,等海洋细菌B-9987菌株产生的抑菌物质及对几种植物病原真茵的作用植物病理学报, 2003, 33(1):77-80
[13]李德顺,苏中锐,袁志刚,等1山东链霉菌产抗真菌物质的理化性质的初步研究山东农业大学学报(理学版), 2004, 39(6):121-124
[14]陈文君,吴剑波,全启光1农用抗生素11371各组分的分离纯化和鉴别中国抗生素杂志, 1990, 15(1): 42-48。