大肠杆菌噬菌体的分离_纯化及其特性研究_郭秋菊

无尾鞘、基板、尾丁、尾丝等结构. 二是蝌蚪 状可收缩尾的噬菌体, 其头部为三十面体, 约 70 nm 110 nm, 尾部长 约 120 ~
130 nm, 尾宽约 18~ 22 nm, 有尾鞘、基板、尾丁、尾丝等结构 , 该类噬菌体在 污水中占绝 大多数. 三是短尾 噬菌体, 其头部
为二十面体, 大小为 20 nm, 尾部长约 2~ 3 nm, 在污水中占有 一定的比例. 2种噬菌体在 - 18 冰箱可存活 56天. 经噬菌
体处理的污水, 总菌数下降了 30% 左右, 大肠杆菌总数下降 90% 以上.
关键词: 大肠杆菌; 噬菌体; 分离; 纯化; 特性
中图分类号: Q 939. 48
文献标识码: A
文章编号: 0438 0479( 2008) S2 0273 05
噬菌体是以细菌为寄主的一类非细胞微生物. 自 1911年发现噬菌体以来, 人们几乎立即就将兴趣转移 到了应用噬菌体预防和治疗细菌性感染上. 1917年法 国的 Fe lixd H erlle利用噬菌体治疗鸡伤寒、兔痢疾取 得成功 . 此后, 关于噬菌体对感染性疾病的防治经久 不衰, 现已证明利用噬菌体可以控制大肠杆菌引起的 犊牛、仔猪、羔羊的腹泻, 治疗大鼠的大肠杆菌感染, 在 对鸡肉接种大肠杆菌的同时在鸡体不同部位注射噬菌 体, 则可保护鸡免受大肠杆菌的感染. 1992年, Sootill 发现噬菌体可以保护小鼠免受鲍曼不动杆菌、绿脓假 单胞菌的感染. 现在, 噬菌体在人、畜、鱼的传染性疾病 的防治方面发挥着重要的作用 [ 1 2 ] . 在国内, 自上世纪 50年代应用绿脓杆菌噬菌体治疗大面积烧伤病人, 成 功地解除因耐药性而长期不能治愈的问题以来, 噬菌 体的应用研究也逐渐开展. 张培东、陈萍、孙海虹等相 继分离了噬菌体, 研究了它们的生物学特性, 探讨了它 们的应用价值, 试图应用于鸡等感染性疾病的防治, 取 得显著的进展 [ 3 6] . 但是, 这些研究大多数集中在人和 动物传染性疾病的防治方面, 在环境的治理方面的应 用研究报道较少, 因此我们试图分离纯化污水中的噬 菌体, 掌握其生物学性质, 应用所得噬菌体处理、净化 生活污水, 减少生活污水中病原性细菌的危害.
在, 而经富集后的样品则能很容易地检测到噬菌体的 存在, 说明噬菌体的分离必须经过富集. 2. 2 噬菌体的分离
于每个平板加入 14 m L 蒸馏水, 捣碎, 静置, 吸取 上液用于负染; 或溶液于 4 000 r/m in离心 15 m in, 供 负染观察; 或离心后再经微孔滤膜过滤后供负染观察.
2. 3 噬菌体的纯化 噬菌体纯化结果见图 2, 平板空斑表明各目的斑样
品都能获得纯化, 且纯化后它们的空斑大小较为一致.
表 1 样品富 集与不富集效果的比较 T ab. 1 T he com pare between the sam ples enriched and un enriched
水样 处理方式 结果
第 47卷 增刊 2 2008年 12月
厦门大学学报 (自然科学版 ) Journal o f X iam en Un iversity ( N atura l S cience)
V o.l 47 Sup. 2 D ec. 2008
大肠杆菌噬菌体的分离、纯化及其特性研究
郭秋菊, 滕井华, 许荣均, 梅青青, 龙鑫泉, 沈明山*
分别吸取厦门港排污口污水 10 mL 于两管中. 一 管加入噬菌体悬液 1 mL, 混合 5 m in后进行 10 倍稀 释, 取不同稀释度混合液 1 mL 于培养皿中, 用 EMB 培 养基倾注法分离、计算大肠杆菌总菌数. 另一管不加噬 菌体, 按上述方法用 LB 培养基倾注法分离、计算总菌 数.
1. 3 噬菌体的纯化 用接种针穿入目的斑, 于 0. 9 mL LB液体培养基
中, 再经 10倍梯度稀释后, 加入 1. 0 m L大肠杆菌菌悬 液. 各稀释样品分别与 10 mL 60 固体 LB 培养基混
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厦门大学学报 (自然科学版 )
20 08 年
匀后迅速倒入培养皿中, 37 培养 24 h, 形成单噬菌 斑. 1. 4 噬菌体的形态观察
保存天数 /d
保存效果 / ( PFU mL- 1 )
平板保存
悬液保存
15
1. 38 106
30
7. 72 103
6. 24 105 8. 66 102
45
4. 8 10
0. 8 10
56
0
0
15
8. 48 107
30
2. 26 104
Fra Baidu bibliotek
45
厦大东大沟 不富集 -
厦大南大沟 不富集 -
厦港排污口 不富集 -
厦大东大沟 富集 ++
厦大南大沟 富集 +
厦港排污口 富集 +++
注: - 无法 分离得到噬菌体; + 可以分离得到噬菌体; + + 可以分离得到较多的噬菌 体; + + + 可以分离得到更多 的噬菌体
图 2 从不同噬菌斑中纯化的噬菌体产生的噬菌斑 F ig. 2 The plaques formed by the pur ified phage from different nega tive co lonies
1. 5 噬菌体保存时间的分析
供分析的材料有 2种, 一种是已纯化的平板保存 于 - 18 , 分析时取出, 加入蒸馏水, 捣碎, 静置后, 吸 取悬液供平板法分析; 一种是取培养 24 h 的平板, 加 入蒸馏水, 捣碎, 吸取悬液于 - 18 冰箱保存, 供平板 法分析.
1. 6 污水总菌数和大肠杆菌数的测定采用 平板法 [ 7]
从 3种污水来源的 24个空斑克隆, 经制样、电镜 观察, 根据大小、形态结构特征, 可以把所得到的噬菌 体分为 3种类型, 一是蝌蚪状不可收缩尾的噬菌体, 其 头部为二十面体, 直径约 110~ 120 nm, 尾部长 220~ 230 nm, 尾宽 13~ 15 nm, 无尾鞘、基板、尾丁、尾丝等 结构 (图 3 c), 在所观察的 24个样品中只发现 一个. 二是蝌蚪状可收缩尾的噬菌体, 其头部为三十面体, 约 70 nm 110 nm, 尾部长约 120~ 130 nm, 尾宽约 18~ 22 nm, 有尾鞘、基板、尾丁、尾丝等结构 ( 图 3 d、e), 该 噬菌体似有包膜, 在所观察的 24个样品中发现了 19 个, 说明该类噬菌体在污水中占绝大多数. 三是短尾噬 菌体, 其头部为二十面体, 大小为 20 nm, 尾部长约 2~ 3 nm ( 图 3 f) , 在所观察的 24个样品中只发现 4个, 说 明该类噬菌体在污水中占有一定的比例.
经富集后的污水样品经平板分离, 可得到高效价 的噬菌体, 噬菌体效价达 106 ~ 109 /mL, 噬菌斑的直径 在 0. 6~ 3. 0 mm 之间 (图 1). 噬菌斑的大小预示着有 不同的噬菌体被富集的可能性, 为不同噬菌体的纯化 提供了良好的基础. 富集后噬菌体效价的差异可能与 所采集样品的污染程度有关, 也可能与噬菌体的种类 和繁殖能力有关.
图 3 噬菌体的电镜观察照片
a、b. 不经离心、过滤的样品; c、d、e. 经离心、过滤的样品, .f 离心的样品
F ig. 3 The e lectron m icrographs o f the phage
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菌种 具可收缩尾的噬菌体
短尾噬菌体
厦门大学学报 (自然科学版 )
表 2 不同保 存方法的保存效果比较 T ab. 2 T he compare of e ffect between d iffe rent conserva tion w ay s
增刊 2
郭秋菊等: 大肠杆菌噬菌体的分离、纯化及其特性研 究
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2. 4 噬菌体的形态观察
取经纯化的平板, 加入 14 mL 蒸馏水、捣碎, 静置 后直接吸取溶液, 或溶液经离心后取上清液, 或离心后 再经微孔滤膜过滤后作为负染样品, 经 1% 磷钨酸负 染, 电镜观察. 图 3 表明, 3种制备方法都能观察到噬 菌体的形态和结构, 但各种方法都有其优缺点. 不经离 心、过滤的样品背景较杂, 但它可以观察到残存的细菌 及其菌内的噬菌体, 并可以估算 ( 图 3 a、b) 每个细菌 内噬菌体的数目. 离心并过滤的样品, 背景最干净, 但 难于观察到菌内的噬菌体.
2. 5 噬菌体的保存 噬菌体的保存针对具可收缩尾和短尾的噬菌体.
表 2结果表明, 2种保存方法都能保存噬菌体一个月 以上, 但不同保存方法的保存效果有差异, 平板保存的 效果好于提取液保存, 短尾噬菌体的保存时间长于具 可收缩尾噬菌体, 在实验的 56 d内短尾噬菌体仍然具 有感染性 (表 2) . 2. 6 噬菌体处理污水的效果
大学生命科学学院教学部提供 ), 培养基参考文献 [ 7] 配制, 3倍 LB培养基, pH 7. 2~ 7. 4; 其中 LB底层平板 培养基加 2% 琼脂, 上层培养基加 1. 0% 琼脂. EMB 固 体培养基. 1. 2 噬菌体的富集与分离
生活污水采自厦大东大沟、南大沟、厦门港排污 口. 不富集: 污水经过滤除菌, 吸取 1 mL 污水, 与 1 mL 大肠杆菌菌悬 液混匀后, 用双层平 板倾注法分离; 富 集: 污水经过滤除菌, 量取 200 mL 污水, 倒入 100 mL 已灭菌的 3倍 LB 培养基中, 再加入 2 m L 大肠杆菌菌 悬液, 置 90 r /m in 37 摇床培养 12 h; 取富集 12 h的 培养液, 4 000 r/m in 离心 15 m in, 上清 液再用微孔滤 膜过滤得滤液; 在已凝固的 底层 LB 培 养基上涂布 1 mL 大肠杆菌悬液, 待干后, 每板分散 滴加 4 ~ 5 滴滤 液, 37 培养 24 h, 用于证明噬菌体是否存在; 用接种 环对斑区挑取 2环于 0. 9 mL LB 液体培养基中, 再经 10 倍 稀 释, 各 稀 释 样 品 分 别 与 1 mL 菌 悬 液 混 匀 5 m in, 再与 4 mL 60 半固体 LB培养基混匀后迅速倒 入 LB固体培养基上, 37 培养 24 h.
用平板法检测经噬菌体处理的污水细菌和大肠杆 菌总数 ( 图 4), 发现经噬菌体处理的污水总菌数下降 了 30% 左右, 大肠杆菌总数下降 90% 以上.
3讨 论
用污水直接分离噬菌体, 三水样, 3次分离都没有 成功. 这并不意味着污水中不含有噬菌体, 而是噬菌体 的含量太少. 采用富集的方法都可获得大量的噬菌体, 说明富集是分离噬菌体的必需步骤. 研究中取自不同 场所的污水, 富集的噬菌体含量也不相同, 其中, 厦门 港排污口采集的生活污水所含噬菌体最多, 厦大校园 内采集的生活污水已受排放前的预处理, 并受上游水 库水的稀释, 其噬菌体的含量相对较少. 预示那些与人 们生活密切相关、没有经处理的生活污水是分离大肠 杆菌噬菌体的好材料. 分离过程中, 如果噬菌体含量较
收稿日期: 2008 09 30 基金项目: 国家基础科学人才培养基金 ( J0630649) , 2007 年教育部
大学生创新计划项目资助 * 通讯作者: m sshen@ xmu. edu. cn
1 材料与方法
1. 1 菌株来源及培养 菌种: 大肠杆菌 ( E. coli ) CMCC ( B ) 44103( 由厦门
(厦门大学生命科学学院, 福建 厦门 361005)
摘要: 探讨 了从生活污水中分离、纯化大肠杆菌噬菌体的方法. 经富集, 从 厦门大学、厦门港的生 活污水中获 得 3种噬菌
体. 一是: 蝌蚪状不可收缩尾的噬 菌体, 其头部为二十面体, 直径约 110~ 120 nm, 尾 部长 220~ 230 nm, 尾宽 13~ 15 nm,
2结 果
2. 1 样品富集与不富集效果的比较 用上述 3种水样, 做富集与不富集噬菌体实验, 结
果 ( 表 1)表明, 不经富集的样品未能检测到噬菌体存
图 1 从厦门港污水分离所得的噬菌 体产生大小 不同的噬 菌斑
F ig. 1 T he p laque fo rmed by the phag e from the sew age of X iam en ha rbo r