小鼠白血病模型的建立与应用

小鼠白血病模型的建立与应用
孙轶然
【摘要】白血病是一种造血系统恶性增殖性疾病，小鼠白血病模型可以为研究白血病发病机制、相关诱发因素以及评价白血病治疗药物和方法提供帮助。

本文综述了小鼠白血病模型的研究意义、分类、模型建立方法和模型的应用。

【关键词】白血病，小鼠，疾病模型，动物，活体动物光学成像
1、研究意义
1.1白血病的发病机制和分类白血病是一种造血组织的恶性增殖性疾病，患者的骨髓以及其他造血组织大量无核细胞出现无限增值，克隆中的白血病细胞失去进一步分化成熟能力而停滞在细胞发育的不同阶段。

临床表现为骨髓、脾、肝等造血器官中的白血病细恶性增生肿大，并浸润到全身各组织脏器中，伴有不同程度的贫血、出血、感染发热以及骨骼疼痛。

根据统计，白血病约占肿瘤总发病率的3%左右，是儿童和青年中最常见的一种恶性肿瘤[1]。

白血病的发病率在世界各国中，欧洲和北美发病率最高，其死亡率为3.2~7.4/10万人口。

亚洲和南美洲发病率较低，死亡率为
2.8~4.5/10万人口。

白血病根据白血病细胞的成熟程度和自然病程，白血病可分为急性和慢性两大类。

急性和慢性白血病又可根据白血病细胞系列归属各自分为急性髓系白血病（AML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性粒细胞性白血病（CML）、慢性淋巴细胞性白血病（CLL）[1]。

其中淋巴细胞恶性增值引发的癌症又称为淋巴癌，可以分为霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤两大类。

在过去几十年里，非霍奇金金淋巴瘤（NHL）的发病率和死亡率呈上升趋势，在美国NHL占癌症发病率的4％。

1.2小鼠白血病模型的研究意义近几年来，癌症的实验动物学模型研究取得了长足进展。

针对各种不同癌症的动物模型被研究人员不断地建立出来，这些癌症动物模型能够帮助人们研究癌症的生物学性质、生化免疫学特征、病理生理状态变化、发病机制，特别是抗肿瘤药的研究包括肿瘤的放射敏感性研究和抗肿瘤药、
抗化学致癌剂体内试验等。

小鼠属哺乳纲-啮齿目-鼠科动物，在遗传学与造血系统等方面和人类十分相似，人类血液系统的髓系、淋巴系等恶性肿瘤均可在小鼠身上获得相应的模型供研究；小鼠易饲养，用近交系小鼠做实验，其遗传背景均一致，实验结果可比性强，实验所需时间短，可进行动态性和前瞻性研究[2]。

在众多癌症的动物模型中，小鼠模型的种类最多，应用范围也最广。

综上所述，小鼠是白血病研究的理想动物模型，建立各种不同种类的小鼠白血病模型对研究白血病发病机制和白血病治疗药物和方案很有意义。

2、小鼠白血病模型的分类
2.1按建立方法分类按照小鼠白血病模型的建立方法，可以将其分大致为：2.1.1 自发模型指不对小鼠进行任何的人为致白血病因素的接触，而在小鼠自然生长过程中发生白血病，或由于基因突变的异常表达通过定向培育而保留下来的疾病模型。

小鼠自发的肿瘤一般比科研人员通过实验方法诱发的肿瘤更有利于将实验结果推及到人体，且在遗传因素对肿瘤发生的影响、以及统计分析环境和其他因素对肿瘤发生的研究方面有很大意义。

但是该类方法也存在肿瘤的发生情况参差不齐，不可能在短时间内获得大量肿瘤学材料，观察时间可能较长，实验耗费较大等缺陷[3]。

2.1.2诱发模型指研究者通过使用理化和生物因素作用于小鼠而人为造成白血病的疾病模型，如病毒、化学致癌剂、放射线均可诱发白血病。

诱发性动物模型制作方法简便，重复性好，在短时间内可诱导出大量疾病模型，并能严格控制各种条件使的疾病模型适合研究目的需要，因而在白血病研究中最为常用，广泛用于药物筛选、毒理、传染病、肿瘤、病理机制的研究[3]。

但该模型又有一定的局限性，因为是通过人为限定方式而产生的，多数情况下与临床所见自然发生的疾病有一定差异，且目前还不能用人工诱发的方法复制所有种类的癌症[4]。

2.1.3同种、异种移植模型这类模型统称为移植性小鼠白血病模型。

是指来同种动物或异种动物和人体的白血病细胞，如外周血、脾、骨髓等，移植给同基因或同种动物的皮下、腹腔、静脉或脑组织等而建立起来的白血病细胞动物模型。

使用可移植性白血病细胞株在建立白血病动物模型的优点是可供选择使用的细
胞系或细胞株多，许多细胞系在世界范围分布广泛。

这些细胞的生物学特性已经比较明确，一般都有明确的背景资料，使一群动物同时接种同样量的瘤细胞，生长速率一致，个体差异较小，成活率接近100%，易于对照观察[5]。

缺点是由于一些被广泛使用的可移植性白血病细胞系，长期在不同单位和经不同条件下体内、外培养传代，随着时间的推移，细胞系的特性可能已发生变化，这些变化对于实验的准确性和可比性将产生影响[6]。

2.1.4转基因和基因敲除模型统称为基因修饰小鼠白血病模型。

转基因动物模型指将外源基因导人小鼠受精卵，产生携带外源基因能通过生殖细胞将外源基因传递给后代的小鼠品系；基因敲除小鼠模型指利用外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组，使之整合到预定位点上，并替代原有基因，从而改变小鼠细胞遗传性获得的白血病小鼠模型。

2.2建立模型所用小鼠品系目前常用于建立白血病小鼠模型的小鼠可分为有近交系和突变系小鼠。

2.2.1 近交系小鼠可用于建立白血病小鼠模型的小鼠品系主要包括BALB/c小鼠、C57BL小鼠、AKR小鼠、C58小鼠、L615小鼠等。

其中BALB/c小鼠的白血病发病率较高，对辐射很敏感；C57B小鼠对白血病因子较敏感和放射线很敏感，但对化学致癌物诱导作用敏感度较低，C3H、C57BR和C57BL等近交系小鼠对全身X射线照射非常敏感；AKR小鼠和C58小鼠是良好的自发性白血病模型用小鼠；L615品系小鼠，在其基础上培育出的多种品系小鼠，被广泛用于抗白血病药物的筛选以及白血病免疫与机理的研究中。

2.2.2 突变系小鼠可用于建立白血病小鼠模型的小鼠品系主要包括nude小鼠、SCID小鼠、NOD/SCID小鼠和NOD/SCID IL-2 Rgamma(nul1)小鼠等。

nude小鼠即裸鼠，主要表现为无毛以及缺乏正常胸腺，无胸腺裸体鼠是研究胸腺功能最适宜的天然动物模型，它的发现为肿瘤学等的研究提供了难得的模型；SCID小鼠即重度联合免疫缺陷小鼠，小鼠被毛白色，体重正常，但胸腺、脾、淋巴结的重量仅为正常的30％以下，其体内T和B淋巴细胞联合缺陷，是建立急性淋巴细胞白血病（ALL）的有效模型；NOD/SCID小鼠即非肥胖糖尿病型重症联合免疫缺陷小鼠，是SCID小鼠与糖尿病小鼠的杂交产物，不仅有SCID小鼠的重排缺陷还缺乏功能性NK细胞及循环补体，抗原呈递细胞分化及功能不良，并且不发生
自身免疫性糖尿病，因而是一种免疫缺陷更严重、更易于异种移植成功并可稳定应用的动物模型。

NOD/SCID IL-2 Rgamma(nul1)是在NOD/SCID小鼠模型的基础上导人IL-2受体γ链缺失突变，建立的小鼠模型，有报道称其在人类淋巴造血系统移植和功能方面的研究与应用明显优于普通的NOD/SCID小鼠[7]。

3、模型建立方法
3.1自发模型的建立自发性白血病小鼠模型的建立比较简单，因为小鼠适龄之后会自动出现白血病，因此只需观察、统计，即可筛选出合适的白血病模型小鼠。

如C58小鼠，至6个月龄后白血病的发生率在85％以上，多为淋巴细胞白血病；AK小鼠至6～9个月龄时，白血病的发生率可达70～90 ，多为胸腺来源的淋巴细胞白血病[5]。

AKR自发白血病小鼠，生时即带有致癌的RNA病毒，对药物的治疗反应类似儿童ALL[3]。

3.2诱发模型的建立
3.2.1 病毒诱发模型的建立最早利用病毒诱发白血病的研究是1951年Gorss应用AK近交系白血病小鼠的无细胞提取液接种C3H近交系新生乳鼠诱发白血病，随后病毒与白血病的关系引起了人们很大的关注。

各国在随后的研究中建立了各种病毒诱导白血病的方法。

李永念等[8]用L6565小鼠白血病病毒（L6565 MLV）悬液感染乳鼠，观察并动态检测小鼠体内病毒核酸的分布，结果发现小鼠感染病毒后3～5周，其脾脏和淋巴结呈早期白血病的病理改变，至第10～12周小鼠发生淋巴细胞白血病。

3.2.2化学致癌剂诱发模型的建立：用来诱发动物白血病的化学致癌剂包括多环碳氢化合物如9,10-二甲苯并蒽和亚硝基脲类如丁基亚硝尿等。

褚建新等[5]应用马利兰诱发615系小鼠产生L7811系小鼠发生腹水型白血病。

3.2.3放射辐射诱发模型的建立目前主要用X线、射线等照射小鼠全身，或用同位素于动物体内积蓄诱发动物白血病发生。

C3H、C57BR和C57BL等近交系小鼠对全身X射线照射非常敏感，其照射后白血病的诱发率可高达90%[5]。

Hattori 等[4]用3.5 Gy的γ射线照射Swiss小鼠和C57B/6小鼠，发现46％的Swiss小鼠发生B 细胞淋巴瘤，而50％的C57B/6鼠发生胸腺肿瘤。

3.3 同种、异种移植模型的建立常用的可移植性白血病模型有小鼠淋巴细胞白血病U210和P388，EL9611红白血病模型，小鼠网织细胞白血病L615，Friend 病毒白血病，Dunning白血病，白血病L5170Y，P1534淋巴细胞白血病，P315白血病等[5]。

3.3.1 同种移植模型的建立如小鼠白血病模型L615，可先用T638病毒给新生的L615近交系小鼠皮下或腹腔接种，发生白血病后，取白血病小鼠的脾或骨髓制成单细胞悬液给正常成年L615小鼠皮下或腹腔接种，发病后再以同样的方法在L615小鼠中连续传代建模。

该种方法的建模周期短，重复性好，移植的肿瘤细胞生物特性较稳定，故成为国内外常用的白血病动物模型复制方法之一[9]。

自体式同系动物肿瘤移植不产生排导现象，同种移植时可结合注射肾上腺皮质激素、抗肿瘤药物和适量放射等方法，降低宿主免疫排斥反应，提高建模成功率[4]。

3.3.2 异种移植模型的建立异种移植方法建立白血病模型时会由于免疫系统功能的排斥可能会导致白血病异种移植失败，虽然人实体瘤细胞容易在小鼠体内存活，但人白血病小鼠模型却很难构建。

可通过化疗药物和照射的预处理抑制小鼠免疫功能，预处理24小时后经过尾静脉或腹腔注射1×106～2×106 个瘤细胞，一般4～6周左右成模[3]。

刘媛等[10]研究了融合基因AML/ETO阳性的人急性粒细胞白血病M2白血病细胞Kasumi-1在BALB/c裸鼠体内建立白血病模型，他们的预处理方法是利用放射线以及环磷酰胺。

李丽霞等[11]通过对裸鼠腹腔注射环磷酰胺预处理，24小时后注射Nalm-6细胞，成功建立了B-ALL小鼠模型，用于药物体内靶向杀伤的研究。

邵晓枫等[12]采用5周龄左右的雌性BALB/c-nu/裸鼠腹腔注射pristane 0.2ml/只2次，经60Co照射，3天后腹腔内接种人B淋巴瘤细胞株(Raji)1×107/只，结果接种38只均获成功，成瘤率100%。

杨文华等[13]通过给NOD/SCID小鼠尾静脉注射白血病人骨髓单个核细胞（BMMNC）或CEM细胞株的方式，建立人白血病-NOD/SCID小鼠髓外浸润模型。

3.4基因修饰小鼠白血病模型的建立
3.4.1 转基因小鼠1976年美国科学家Jaenisch等利用反转录病毒把莫氏白血病病毒基因插入小鼠基因组，建立了世界上第一个白血病转基因小鼠系，随后又有研究将vtAT与强力霉素结合，从而抑制四环素操纵子调控基因的时相表达，由此构建成功了Bcr-Abl阳性的CML模型[14]。

另有报道可用HTLV-1基因成功
建立转基因白血病小鼠模型[15]。

3.4.2基因敲除小鼠Kawagoe等[16]成功敲除MN1-TEL融合基因，构建成AML小鼠模型，用于研究MN1-TEL对白血病的作用机制。

Carella[17]构建了C BFβ-SMMHC基因敲除小鼠，并用于研究CBFβ-SMMHC致AML发生的机制。

4、小鼠白血病模型的应用
4.1 白血病细胞系的建立
SCID小鼠比体外培养体系为人类白血病细胞的生长提供了更为合适的环境，而作为一种“体内组织培养皿”支持人白血病细胞的繁殖，从而为白血病细胞系的建立提供了新的工具[3]。

4.2在骨髓新生血管方面的应用研究
血管生成在多种癌症发病机制中起着重要作用，其中也包括白血病。

郭海霞等[18]通过对NOD/SCID小鼠静脉注射HL60细胞和内皮细胞（EC），小鼠14天时出现全身白血病症状，证明了人EC可被HL60趋化至骨髓，参与局部肿瘤血管生成，并认为模型可用于抗白血病血管生成及实验研究。

4.3微小残留白血病的诊断和治疗
微小残留是导致癌症复发的直接原因。

利用SCID鼠建立的白血病模型可用于微小残留白血病的诊断，有研究表明，接种3×106～10×106个ALL复发患者的白血病前B细胞，即可导致SCID鼠发生白血病，从而为诊断微小残留白血病提出了新方法[18]。

史剑慧等[19]采用P388白血病细胞系和DBA小鼠建立了P38/DBA小鼠微小残留白血病模型，并研究了微小残留白血病细胞在体内的分布规律，移植生物试验提示，当微小残留白血病细胞数量在10个左右时，其分布可能局限于肝、脾及股骨骨髓以外的器官和组织中。

4.4 白血病的治疗敏感度评价试验
4.4.1白血病的放射性敏感试验谭业辉[20]等使用615小鼠和L615K淋巴细胞白血病细胞株建立T淋巴细胞白血病小鼠模型，给予75 mGy的低剂量辐射后，检测外周血白细胞数、小鼠的生存时间。

结果发现接受75 mGy的低剂量辐射后，荷瘤小鼠白血病细胞生长受抑，生存期延长，并得出低剂量辐射具有抗淋巴细胞白
血病的作用。

4.4.2化疗药物敏感度评价化疗药物是目前治疗癌症的主要手段之一，但癌细胞耐药性一直是阻碍癌症治疗研究的一大难题。

小鼠白血病模型可帮助研究人员更好地研究新的癌症化疗药物治疗方案和化疗新药。

Zuber等[21]通过建立AML小鼠模型后进行了化疗药物反应实验，发现AML模型鼠化疗药物的体内反应良好。

4.4.3新型抗瘤药物和抗癌治疗方法的敏感度评价：Zhang等[22]将proIL-18基因修饰的L1210细胞和ICE基因修饰细胞皮下种植到白血病小鼠体内，观察到联合应用Lpl8和LpICE后自然杀伤细胞的细胞毒作用和细胞毒T细胞活性增强。

另外小鼠白血病模型还被广泛应用到白血病的免疫治疗、新型肿瘤凋亡诱导因子、抗肿瘤血管生成的治疗方案中。

4.5 其他应用小鼠白血病模型的应用还包括：评价化合物的致癌性，为新药药理毒理试验提供依据；移植免疫研究，中医药抗癌药物药理研究等。

5、活体动物光学成像系统在小鼠白血病模型中的应用
活体生物发光成像系统是发展起来的一门新技术，已在药理学研究和诊断学研究中得到了广泛的应用。

通过灵敏的光学检测技术，研究者能够观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。

该项技术主要以荧光素酶标记细胞、荧光蛋白标记细胞、病毒、DNA、基因表达和生物大分子以及利用荧光素酶标记的转基因动物模型进行一系列研究。

以荧光素酶或荧光蛋白标记细胞, 利用皮下、静脉或原位接种后, 可实时观察这些细胞在体内的生长、转移以及对药物的反应等。

利用该系统准确的定量性能和成像特性，根据发光强度和位置判断肿瘤的进程，可以直接快速地测量肿瘤的生长和转移。

研究者已经以活体动物光学成像系统建立了多种小鼠肿瘤模型，比如乳腺癌的小鼠模型，李艳等[23]通过用脂质体包裹带有neo抗性基因及荧光素酶报告基因的真核表达质粒pGL4. 17[ luc2 /neo]，体外转染人乳腺癌细胞株MCF27，将获得稳定表达荧光素酶的乳腺癌细胞株（MCF272luc）进行皮下接种BALB/c裸鼠及尾静脉接种SCID小鼠，成功建立了BALB/c 裸鼠皮下移植瘤模型和SCID小鼠
尾静脉移植瘤模型。

目前活体动物光学成像系统建立的小鼠白血病模型已在评价微小残留白血病的诊断和治疗方法中得到了应用。

许小平[24]等利用绿色荧光（EGFP）基因标记的小鼠多药耐药白血病细胞系P388/VCR-G和DBA小鼠建立了一个检测多药耐药微小残留白血病的小鼠模型，用以证实该白血病模型小鼠对环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)敏感，有较好的药物剂量-生存时问关系，且接种细胞的对数与CTX剂量问有良好回归相关关系，并监测EGFP+细胞是检测小鼠体内微小残留白血病细胞最敏感的方法。

5、总结
综上，小鼠白血病模型建立方法简便、成本较低、周期短；可重复性高，肿瘤生物学特性稳定；可控制性好，可以根据研究目的选择相应模型，根据实验要求在小鼠身上复制，因此已成为国内外研究白血病的重要工具。

当然，小鼠模型仍存在一定局限性，比如用于移植的白血病细胞株目前无统一的监控机制，不能保证某些细胞株已发生变异；小鼠体内的某些微环境和因等子与人类存在很多差异，无法完全实现对人造血系统的模拟，且小鼠模型所展示的治疗效果不能完全说明该药物或治疗在人体上的效果和安全性，因此小鼠模型虽然避免了人体试验的危险性，仍需更加详细的药效和安全性试验。

但相信随着技术和理论研究的发展，科学工作者能够解决这些问题，建立更加完善的白血病模型，为人类攻克白血病难题提供帮助。

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