飞秒激光在生命科学中的应用

国家973课题“ 国家973课题“植入前胚胎发育遗传学诊断的分子雷达 973课题 －光学相干技术系统研究” 。 光学相干技术系统研究”
细胞大
三维
脆弱
低损
发育
动态
植入前胚胎发育过程
四维成像
数据直观的四维量化 直观的四维量化
研究内容与特点
内容：建立胚胎细胞四维成像手段, 观察小鼠植入前胚胎发育过程的现象，以 获得植入前胚胎的遗传诊断信息。 特点：以直观的四维量化的数据表达 一个生物学发育过程的信息。
早期胚泡期透视图、荧光图和3D重构量化模型图
Apoptosis body
凋亡小体
Hoechst 33342 (Molecular Probes） staining ） object: 40X Zoom：2.00 ： Box size：512×512(171.9µm×171.9µm) ： × × Pixel size：0.336µm/pixel ：
立项背景
要深入地了解复杂的生物系统需要更量化的生物学 “Bio-X” 当生物学日益需要更丰富的数据时， 当生物学日益需要更丰富的数据时，它就愈加要求具有物理 科学特点的分析方法和计算方法。 科学特点的分析方法和计算方法。 由于生命现象的复杂性，直观、 由于生命现象的复杂性，直观、形象的检测技术在生命科学 的研究中起着非常重要的作用。 的研究中起着非常重要的作用。可视化检测手段的出现和发 使人们能够在一定程度上直接地对生命过程进行观测。 展，使人们能够在一定程度上直接地对生命过程进行观测。 物理成像技术研究是目前bio-X研究中的热点课题。 研究中的热点课题。 物理成像技术研究是目前 研究中的热点课题
8细胞阶段紧密化与去紧密化过程
八细胞期胚胎紧密化与去紧密化的观测
紧密化（compaction）：八细胞 期松散的细胞之间突然通过细胞 挤压连接形成致密的球体 胚胎发育过程中第一次在形态和 分化潜能开始出现本质的区别
Fura-2，Hoechst 33342 staining ， Objective: 20×， Frame: 343×343µm × ×
GFP转染-拟南芥生长过程观测
GFP转染GFP转染-拟南芥的培养和生长过程观测 转染
实验意义
拟南芥：生物学研究的模式生物之一 拟南芥： 形体微小，种子0.2-0.3um ，成熟植株高约 成熟植株高约15cm 形体微小，种子 生长周期短，仅为6-8周 生长周期短，仅为 周 自花授粉， 自花授粉，容易结果
我们用飞秒激光双光子 激发荧光技术观测到小 鼠植入前囊胚阶段胚胎 中凋亡细胞(粉红色) 的四维分布图。
凋亡小体空间量化模型3D旋转图 凋亡小体空间量化模型3D旋转图
植入前胚胎细胞凋亡现象观测 Apoptosis in the mouse preimplantation embryos
凋亡小体在胚胎4个球壳区域的分布比例
成果介绍
小鼠受精卵细胞 Ca2+和 DNA 的四维分布图 小鼠受精卵细胞的有丝分裂过程 8细胞阶段紧密化与去紧密化过程 植入前胚胎细胞凋亡现象观测 GFP转染-拟南芥生长过程观测
小鼠受精卵细胞 Ca2+和 DNA 的四维分布图
我们用飞秒激光双光子激发 荧光技术观测到小鼠受精卵 细胞 Ca2+（ indo-1染色） 和DNA (hoechst染色，红色) 的四维分布图
实验室科研探究 ???…
飞秒激光成像技术 在生命科学中的应用
马万云
原子分子纳米科学教育部重点实验室 2007
飞秒激光的特点
脉冲很窄：几个飞秒，1fs=10-15s， 1／1000万亿秒， 比利用电子学方法所获得的最短脉冲要短几千倍。 瞬时功率很高：>1012W。 能聚焦很细：能聚焦几百nm,比头发的直径还要小的 空间区域，使电磁场的强度比原子核对其周围电子的 作用力还要高数倍。
2
σ： two-photon absorption cross section
( 一般为 - 50 cm4s/ 光子 一般为10 光子)
单光子激发荧光 在整个照明区 均产生荧光
双光子激发荧光 仅在焦点附近产 生荧光
单光子激发的能量特性 Power-lined Dependence of One-Photon-excited Fluorescence
近红外光 穿透深度深 光毒性小 光漂白小
双光子的优势
荧光收集效率高 样品活 穿透深 观测时间长
共焦显微技术与双光子技术成像比较
四维成像原理（三维空间，一维时间）
从点到二维图像
激光共聚焦显微镜在同一时刻对样品中的一点成像 这一点的像在屏幕上显示为一个像素 为获得样品的二维图像，激发光的聚焦点必须在样品上移动
Scan Head
倒置显微镜、扫描系统、探测系统 （ MRC-1024，美国伯乐公司Bio-Rad ） 激发光源为锁模飞秒脉冲掺钛蓝宝石激光器（Tsunami，Spectra Physics）。 脉冲宽度70fs左右，重复频率82MHz，波长可调范围720~1080nm，输出的平均 功率可调，最高可达1 W 。
应用广泛：外科手术、医学成像 、生物活体检测、病变早期诊断……
重点:飞秒激光双光子成像技术对大、厚、活的生物样品的四维实时观测 重点:飞秒激光双光子成像技术对大 的生物样品的四维实时观测
科研项目
植入前胚胎发育遗传学诊断的分子雷达-光学相干 技术系统的研究－－国家973计划（2002-2007） 001CB510307 ， 正在进行。 活细胞中生物大分子相互作用的四维可视化观测-国家自然科学基金项目（2005-2007） 10474054， 正在进行。 高灵敏实时原位观测方法相关物理、化学基础问 题及其在生命科学中的应用--教育部科学研究重大 项目 (2006-2008) 306020，正在进行。
植入前胚胎细胞凋亡现象观测
植入前胚胎中细胞凋亡的研究
凋亡过程示意图
细胞收缩 染色体浓缩、凝聚 细胞器减少 细胞膜出泡 凋亡小体 膜完整 无炎症
细胞凋亡（programmed cell death, PCD） 细胞自主的、有序的死亡 apoptosis 凋亡是生物体发育过程中的重要现象
小鼠植入前胚胎中细胞凋亡现象
活细胞的四维成像技术 物理原理
共聚焦成像技术 双光子成像技术
单光子激发， 单光子激发，采用普通连续激光
采用较高功率的超短脉冲激光 几十fs的脉宽 的脉宽， （几十 的脉宽，1fs=10-15秒） 激发荧光物质， 激发荧光物质，使之跃迁到激发 态时能同时吸收两个光子。 态时能同时吸收两个光子。
共聚焦显微镜原理
• 要获得样品的三维信息，激发光聚焦点不仅要在XY方向上移动，还要在Z方向 上移动 • 通常，在扫描一个XY平面后，通过载物台的垂直移动使激发光聚焦点在Z方向 上移动 • 结果是一个三维数据序列，包含着若干幅代表样品中不同光学切片的XY图像
飞秒激光双光子激发荧光装置
Comp Filter PMT PMT Femtosecond Laser System BS
• 图中左边为双光子为荧光图，右边为透射图； • 每幅荧光图之间的时间间隔为30分钟； • 荧光图中椭圆内红色的两排为染色体，由图 01-05可以看出细胞以及细胞内染色体和细胞质 的旋转运动集细胞的拉长。 • 图片大小 92.4×92.4µm
小鼠受精卵细胞的有丝分裂过程
我们用飞秒激光双光子激发荧光技术观测到小鼠受精卵细胞的有丝分裂过程
去紧密化过程 每张小图大小44X40um 每张小图大小
紧密化过程 每张小图大小66X60um 每张小图大小
3D images of 8-cell stage 8-
紧密化后腔的形成
Light transmitted image (upper left) Montage of optical sections from upper to bottom (right) Fura-2 staining
实验对象的选择
■小鼠一直是生物学和医学研究中重要的模型动物，也是基因 组测序的重点对象之一。 ■ 2002年12月5日国际老鼠基因组测序联盟成功破译了小鼠基 因组序列。基因测序表明，人类与小鼠共享着80％的遗传物 质和99 ％的基因。 ■通过研究小鼠胚胎，将非常有助于了解人类自身，有助于了 解人类的胚胎发育过程及基因变异与疾病的关系，为临床上 人胚胎的植入前遗传诊断等提供重要的信息。
双光子激发的能量特性 Power-Squared Dependence of Two-Photon-excited Fluorescence
双光子与共聚焦的比较 双光子与共聚焦的比较
共同点： 分辨率高，信噪比高，光学切片，三维重构
共聚焦缺点
双光子优点
紫外光 穿透深度浅 光毒性大 光漂白区域大 散射荧光丢失
ICM（内细胞团）
凋亡小体壳层分布
60.00%
囊胚腔
50.00% 分布比例 40.00% 30.00% 20.00% 10.00% 0.00% 1
ICR 昆明白
TE（滋养外胚层）
2 壳层
3
4
凋亡小体的壳层分布比例
等厚球壳层
凋亡绝大部分分布于胚胎的外围（外面两个球壳），最可 能发生于滋养外胚层（近70%），与文献理论预测一致
拟南芥花
转染：产生 转染：产生GFP的基因与植 的基因与植 物本身的肌动蛋白基因融合， 物本身的肌动蛋白基因融合， 因此植物细胞骨架中产生 GFP。GFP转染的种子 。 转染的种子 由植物所赠送。 由植物所赠送。
GFP（绿色荧光蛋白，ex488nm、em507nm） （绿色荧光蛋白， 、 ）
植物细胞骨架与细胞的各种运动密不可分， 植物细胞骨架与细胞的各种运动密不可分，而 其各种功能的实现与其动态结构紧密相关， 其各种功能的实现与其动态结构紧密相关，因 此细胞骨架的观测有助于了解其如何影响细胞 运动。 运动。
Confocal laser scanning microscopy (CLSM)
位于共轭焦平面的小孔（ 位于共轭焦平面的小孔（共 聚焦针孔）， ），阻挡了来自焦 聚焦针孔），阻挡了来自焦 平面以外的信号
共聚焦针孔的直径直接控制 了光学切片的厚度
为什么要用超快激光？
I 2σ W 2 ≈ 0.664 2 τf πA 2 hcλ
观测结果
种子： 种子： 三维） （三维
左图高659um；右图高343um ；右图高 左图高
观测结果
根尖： 根尖： 三维） （三维）
图像高 343um
根尖生长过程
生长速度： 生长速度：0.29um/min 图像大小343X343um 图像大小
TimeTime-lapse imaging of the cleavage of the mouse zygote
图中红色的逐渐分开的 两排为染色体，每两幅 图之间的时间间隔为10 分钟，从图上我们可以 看到细胞内染色体分开 的过程以及细胞形态的 变化过程。 分裂速度0.455μm/min
Time-lapse imaging of the cleavage of the mouse zygote. Pixel size: 512×512 (92.4×92.4µm ), time between each two images is about 10min. The splitting of the chromosomes at 0.455µm/min and the morphological changing of the cell are obvious, while the orientation of chromosome splitting is not consistent with orientation of the zygote’s morphological splitting. Red, Hoechst 33342 staining of chromatin; Green, indo-1 staining of calcium (artificial colour).
ຫໍສະໝຸດ Baidu
• 扫描镜驱动激发 光束以线的方式 移动 • 扫描过程中得到 的像素构成最终 的二维图像 聚焦光锥
X
X/Y 图像
Y
样品
从点到三维图像
• 通过激发光的水平移 动（X/Y），得到样品 中某一特定层面的二 维图像 • 这一层面代表了样品 中的一个光学切片 Z轴驱动 • 无物理接触的采集 X/Y/Z 序列