药物敏感性实验

药物敏感性实验
●学习内容
●药物敏感实验¡ª¡ª纸片法
●学习要求
●掌握药物敏感实验的原理、方法及注意事项。

●抗菌药物敏感性试验（AST，简称药敏试验）：
●用于测试抗菌药物在体外对病原微生物有无抑制作用。

常用最低抑菌浓度（MIC）表示，即体外能够抑制细菌生长的最低药物浓度。

通常根据MIC结合常用剂量时体内该药所能达到的血药浓度，划定细菌对各种抗生素敏感或耐药的界限，给出S（敏感）、I（中介）、R（耐药）等定性的结果，方便临床用药。

●检测病原菌对各种抗生素的敏感性，指导临床合理用药。

用于流行病学调查及院内感染的监控，控制和预防耐药菌株的流行。

为经验用药提供参考依据。

●方法：扩散法（纸片法）、稀释法（琼脂稀释法、宏量液体稀释法、微量液体稀释法）
●药敏纸片的人工制作
●定性滤纸用打孔器打成直径6mm的圆片，每100片放入一小瓶中，160℃干热灭菌1～2小时，或用高压灭菌（6.8kg 30min）后在60℃条件下烘干。

（此应提前做好）
●抗菌药物的浓度（指有效药物浓度）
青霉素200U/mL 其它抗菌药物1000ug/mL
磺胺类药物10mg/mL 中草药制剂1g/mL
庆大霉素4万单位/mL，稀释为1000单位/mL。

●（临床上可按照药品使用说明书，如上面标明5g本品可拌50kg饲料，其换算方法为lg本品可拌10kg饲料，也就是1g本品拌l0000g饲料，相当于药品浓度为lg本品加l0000mL蒸馏水。

）
●用无菌操作法将欲测的抗菌药物溶液1mL，加入100片纸片中，泡5～10分钟。

●培养皿烘干法：用无菌镊子将浸有抗菌药液的纸片摊平在培养皿中，于37℃的温箱内保持2～3小时即可干燥，或放在无菌室内过夜干燥。

●将制好的各种药物纸片装入无菌小瓶中，置冰箱内保存备用。

●干燥的药敏纸片可保存6个月。

●纸片法
●每组约5个平皿（每人1个），每个平皿约20毫升琼脂培养基，即约120mL。

每平皿约5张纸片。

●将琼脂培养基熔融后，每个平皿倒入约20毫升，晾干。

●用肉汤培养待检细菌，至菌液浊度到0.5麦氏标准。

●用棉球蘸培养好的菌液（棉球均事先消毒）涂抹均匀后晾干。

●用镊子夹纸片，每个平皿贴5张纸片，要使纸片全部紧贴培养基。

为保证均匀，可于平皿背部划出贴纸片点。

●37℃培养过夜。

测量宽度。

药敏试验体外/体内试验可能出现的状况
●稀释法（缺点：操作复杂）
●每组2排试管，每排10支。

共20支。

●将待测定药物用肉汤稀释液成1280U/mL。

●挑选10支无菌试管编号1～12。

●无菌加入1.0毫升肉汤至第2到10管内。

●将1280U/mL药物液体，分别加1.0毫升至第1、2管，将第2管混合后取1.0毫升至第3管，依次至第10管，再从第10管取1.0毫升丢去，第11管不加抗生素作阳性对照。

●试管稀释法
●另准备肉汤管不加抗生素、细菌作阴性对照。

●第1～12管分别加入已增菌6小时的细菌浓度约为105-106cfu/mL菌液1.0毫升（细菌菌龄为16-18小时，McFarland No 0.5管细菌浓度1.5×108cfu/mL，然后用用肉汤1：200稀释）。

●培养和结果判读：37℃培养16-24小时，肉眼观察有无细菌生长。

阳性可见混浊生长，阴性可见澄清。

●含最小药物量仍呈明显不混浊的一管所含的药物浓度即为该抗菌药物对试验菌株的最小抑菌浓度（MIC）。

实验用设备：
超净工作台
高压灭菌锅
恒温培养箱
离心机1台（3000转离心红细胞）
冰箱1台（存放抗原）
振荡器1台（振荡96孔V型板）。